中国地方猪种ESR基因PvuⅡ多态性及其与产仔数关系的研究

1中国地方猪种ESR基因PvuⅡ多态性及其与产仔数关系的研究李明洲张凯李学伟帅素容（四川农业大学动物科技学院，四川雅安625014）摘要：本试验采用PCR-RFLPs方法，研究了中国成华猪、内江猪和太湖猪三个地方品种ESR基因的多态性及其与产仔数间的关系。结果表明，成华猪、内江猪和太湖猪的B等位基因频率分别为0.6389、0.6613和0.6855。在三个猪品种中，除成华猪只检测到AB、BB两种基因型外，在内江猪和太湖猪中都检测到了AA、AB和BB三种基因型。对三个品种不同基因型个体间产仔数的比较研究表明，不同ESR基因型的个体其产仔数存在一定的差异，各品种无论头胎还是经产，总体表现为BB基因型的产仔数高于AB型和AA型个体，而AB型又高于AA型个体。其中，太湖猪BB型个体头胎产活仔数（NBA）（11.13头）显著高于AB型个体（9.42头）（P＜0.05）。证明B基因是对提高产仔数有利的基因。同时还分析了ESR基因PvuⅡ-RFLP的应用前景及其存在的问题。关键词：猪，ESR，PCR-RFLP，PvuⅡ多态性StudyonRelationshipbetweenPvuⅡPolymorphismsofEstrogenReceptorGeneandLitterSizeinChineseLocalSwineLiMing-zhouZhangKaiLiXue-weiShuaiSu-rong(CollegeofAnimalScienceandTechnologyofSichuanAgriculturalUniversity,Ya’an，Sichuan,China,625014)Abstract:WeinvestigatedthePolymorphismsofESRgeneinChineselocalswinewhichincludeChenghuapigs,NeijiangpigsandTaihupigsbyuseofPCR-RFLPs.TherelationshipbetweenESRgeneandlittersizewasanalyzed.TheresultsshowedthatthefrequenciesofalleleBinChenghuapigs,NeijiangpigsandTaihupigswere0.6389,0.6613and0.6855respectively.TherewereAA,ABandBBgenotypesinNeijiangpigsandTaihupigs,whileonlyABandBBgenotypeswerecheckedinChenghuapigs.Comparedwiththefinalresultsofthelittersizeinthesethreebreeds,weknewthatthelittersizeofthedifferentgenotypesexistedcertaindifference,regardlessthefirstparityorthelatterparities,thelittersizeofthreePvuⅡPolymorphismsofESRgeneshowedthetendencyofBBABAAinChenghuapigs，NeijiangpigsandTaihupigs.ThatindicatedtheBalleleofESRisadvantageoustothelittersizeinChineselocalswine.EspeciallyinfirstparityofTaihupigs,NBA（numberbornalive）hadsignificantdifferencebetweenABgenotype(9.42)andBBgenotype(11.13)(P0.05).WealsoanalyzedprospectandproblemofPvuⅡ-RFLPofESRgene.Keywords:swine,ESR,PCR-RFLP,PvuⅡpolymorphism猪产仔数是重要的经济性状，产仔数的提高将会大大地增加商品肉猪的产量，给现代养猪生产带来巨大的经济效益，许多科研和生产工作者正在力求提高产仔性能。特别是近年来，注重用分子生物学方法来研究，Rothschild等(1994)通过候选基因法证明猪雌激素受体(estrogenreceptor,ESR)基因是控制猪产仔数的一个主效基因（该座位在中国梅山猪合成系中可以控制1.5头总产仔数和1头活产仔数），尽管ESR座位控制产仔数的遗传效应在大约克猪种群中有所下降，但却证明了这种遗传效应的确是由ESR基因直接造成的，即ESR座位是猪产仔数的一个QTL，而不仅仅是DNA标记[1,2,3]。Southwood等(1995)发现ESR基因位点造成的遗传方差大约是总产仔数方差的10%，支持了Rothschild等的研究结果[4]。至此，选择ESR基因作为候选基因，研究多基因作用的遗传机制已成为各国的研究热点。业已证明，ESR基因是影响猪产仔数的主效基因且与猪的生长发育性状及胴体性状之间不存在负的基因多效性影响，也是目前预测产仔数最好的标记，其基因频率在外种猪和中国地方品种猪中的分布有较大差异，这对利用DNA标记进行辅助选择以改良畜禽品种具有特别重要的意义。我国地方猪种素有产仔数高、肉质好、抗性强、耐粗饲等优点，尤其是产仔数高这一遗传特性已为世界养猪业做出了很大贡献。但是，对我国地方猪种ESR基因分布的研究甚少，这对我国地方猪种优良遗传特性的合理开发和利用是十分不利的。本试验目的旨在弄清ESR基因在我国地方猪种中的分布，探讨不同基因型与产仔数间的关系，为充分利用我国地方猪种优良的遗传特性提供科学依据,并试图在育种中对ESR基因实现基因型选择。1试验材料1.1试验猪群内江猪62头（52♀，10♂）来自内江市种猪场；太湖猪62头（58♀，4♂），其中10♀来自四川农业大学动物营养研究所实验猪场，其它来自绵阳市畜牧局猪场；成华猪36头（33♀，3♂）来自成都市种畜场。并搜集了本研究所需要的繁殖性状的记录包括总产仔数(totalnumberborn,TNB)和产活仔数(numberbornalive,NBA),其中总产仔数按产活仔数2加死胎计。1.2检测方法[5]：1.2.1样品的采集和保存采集猪毛（带毛囊）30根左右，装入盛有0.85%灭菌生理盐水的离心管(1.5ml)中，冰冻后带回实验室保存于-70℃超低温冰箱中备用。1.2.2DNA的抽提将猪毛用灭菌双蒸水洗净，剪下毛囊放入盛有200ulTE溶液的1.5ml的离心管中，然后加入10%SDS10ul、蛋白酶K（20mg/ml）5ul，混匀，60℃水浴30分钟，37℃水浴12-24小时后，用等体积苯酚-氯仿混合液（苯酚∶氯仿=1∶1）抽提2次，最后用氯仿抽提1次，获得的DNA样品置-20℃保存备用。1.2.3引物合成设计引物参考文献[6]，由大连宝生物公司合成。其引物序列为：ESRF：5'-CCTGTTTTTACAGTGACTTTTACAGAG-3'ESRR：5'-CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG-3'扩增的特异片段长度约为120bp，位于ESR基因的第5外显子。1.2.4PCR扩增PCR反应体系及反应条件如下：PCR反应体系：10×PCRbuffer(含MgCl215mmol)2.5μl；4×dNTPs(2.5mM)2.0μl；Primers(10pmol/μleach)1.4μl；TemplateDNA(25ng/µl)：4μl；TaqDNApolymerase(5U/μl)0.2μl；加灭菌双蒸水至总反应体积25μl。PCR反应条件：940C预变性4分钟，550C退火45秒，720C延伸1分钟，然后进入如下循环（共34个）：94℃变性1分钟,55℃退火45秒，72℃延伸1分钟，循环结束后，72℃延伸8分钟。最后，40C保存。1.2.5RFLP检测RFLP加样如下：限制性酶缓冲液（10×Mbuffer）2.0ul、灭菌超纯水2.5ul、扩增产物12.5ul和1.0ul的限制性内切酶PvuⅡ(15U/ul)，反应总体积为18ul,混匀，37℃水浴3-4小时后，4.5%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）、50-60V电压、电泳3-5小时，紫外投射仪上观察结果，并用英国UVIPro凝胶成相系统扫描保存图像。1.2.6统计分析本试验数据处理采用SAS统计分析软件包，对产仔数进行了最小二乘均数分析，并在此基础上进行了不同基因型间的方差分析。方差分析中所采用的数学模型如下：yijkl=μ+bi+pij+qijk+eijkl其中：yijkl——表示第i品种、第j胎次、第k基因型、第l个个体的产仔数。μ——表示平均数。bi——表示第i个品种效应。pij——表示第i个品种、第j个胎次的效应。qijk——表示第i个品种、第j个胎次、第k个基因型效应。eijkl——表示随机误差效应。2结果2.1模板DNA的抽提结果从数十根毛囊中提取的模板DNA浓度约为25ng/ul,用1%琼脂糖凝胶电泳检测，图谱上可观察到一条光滑整齐的条带（见图1）12345678图1模板DNA的电泳结果Fig.1TheelectrophoreticresultofthetemplateDNA2.2PCR结果-+3从猪毛囊中提取的DNA，经PCR扩增后，用3.5%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果（见图2），由图2可见所扩增的目的片段为一明显亮带，且无杂带。该扩增片段长约120bp，与预测的结果一致。12345678910图2PCR产物的电泳结果Fig.2TheelectrophoreticresultofthePCRoutcome2.3PCR-RFLP结果PCR-RFLP结果如图3所示，从图中可看出经限制性内切酶PvuⅡ酶切后出现多态性，根据条带的数目和位置，确定有3种基因型，分别为AA基因型：120bp/120bp、AB基因型：120bp/65bp+55bp、BB基因型：65bp+55bp/65+55bp。1234M56789101112图3不同品种猪ESR基因的PCR-RFLPs结果1-4，6，8，10-12为杂合子AB型；5，7为纯合子BB型；9为纯合子AA型；M为Marker（DNALadder2000）。Fig.3ThegenotypesofESRdefinedbyPCR-RFLPsindifferentpigbreeds1-4,6,8,10-12:HeterozygoteAB;M:DNADL2000Marker;5,7:HomozygoteBB;9:HomozygoteAA2.4ESR基因频率和基因型频率根据2.3中判断基因及基因型的标准，对试验猪群3个品种进行分析，结果见表1：由表1知，除成华猪只检测到AB、BB两种基因型外,内江猪、太湖猪都检测到了AA、AB和BB三种基因型。ESR基因AB型频率最高，AA型频率最低，而BB型频率以太湖猪最高为40.32%，内江猪次之为37.10%，成华猪最低为27.78%。而等位基因频率在四个猪种中确立为B＞A，其中B基因频率以太湖猪最高为68.55%，内江猪次之为66.13%和成华猪最低为63.89%。表1不同品种猪ESR基因PCR扩增产物经PvuⅡ酶消化后的基因型及等位基因频率（%）Table1ThefrequenciesofgenotypeandalleleindifferentpigbreedsbyuseofPCR-RFLPs(%)品种Breed成华猪（36）Chenghua内江猪（62）Neijiang太湖猪（62）Taihu基因型频率GenotypefrequenciesAA/4.84（3）3.23（2）AB72.22（26）58.06（36）56.45（35）BB27.78（10）37.10（23）40.32（25）等位基因频率AllelefrequenciesA36.1133.8731.45B63.8966.1368.55注：表中括号内