4 第四章 微生物发酵技术

淮海工学院海洋学院1现代微生物学技术Tel:15861240818Email:[e-mail]淮海工学院海洋学院20-101001绪论22微生物资源开发和菌株选育43微生物育种技术64微生物发酵技术65医药微生物生物技术46环境微生物技术67农业微生物生物技术4淮海工学院海洋学院3主要内容1微生物工艺优化的实验设计2发酵过程动力学的基本概念3发酵过程的代谢控制4微生物发酵过程工艺参数控制淮海工学院海洋学院41微生物工艺优化的实验设计•1.1微生物发酵工艺的特点•1.2试验设计中常用的术语•1.3工艺优化的方法和策略淮海工学院海洋学院51.1微生物发酵工艺的特点•应先因素众多•缺乏理论模型•试验误差较大•影响因素间存在相互作用淮海工学院海洋学院61.2试验设计中常用的术语•因素：试验中考察的对试验指标可能有影响的因素简称因素。•水平：每个因素在试验中要比较的具体条件称为水平。淮海工学院海洋学院71.3常用的优化方法•工艺优化研究的主要步骤：筛选：因素多，不精确的知识，找出重要的影响因素；优化：因素少，在较适范围内，建立预言性模型确证：使用预言的最优成套条件，验证结果淮海工学院海洋学院8常用的优化方法•单因子法：实验室最常用的优化方法是单次单因子(one-variable-at-a-time)法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。淮海工学院海洋学院9•多因子试验•多因子试验需要解决的两个问题:(1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。(2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化淮海工学院海洋学院10正交实验设计•正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。•正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步：（1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表；（2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验；（3）根据正交表给出的实验方案，进行实验；（4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。•正交方法可以用来分析因素之间的交叉效应，但需要提前考虑那些因素之间存在交互作用，再根据考虑来设计实验。因此，没有预先考虑的两因素之间即使存在交互作用，在结果中也得不到显示。•对于多因素、多水平的科学试验来说，正交法需要进行的次数仍嫌太多，在实际工作中常常无法安排，应用范围受到限制。淮海工学院海洋学院11均匀实验设计•如果仅考虑“均匀分散”，而不考虑“整齐可比”，完全从“均匀分散”的角度出发的实验设计，叫做均匀设计。•均匀设计按均匀设计表来安排实验，均匀设计表在使用时最值得注意的是均匀设计表中各列的因素水平不能像正交表那样任意改变次序，而只能按照原来的次序进行平滑，即把原来的最后一个水平与第一个水平衔接起来，组成一个封闭圈，然后从任一处开始定为第一个水平，按圈的原方向和相反方向依次排出第二、第三水平。•均匀设计只考虑试验点在试验范围内均匀分布，因而可使所需试验次数大大减少。淮海工学院海洋学院12Plackett-Burman法•Plackett-Bunnan设计法是一种两水平的实验优化方法，它试图用最少的实验次数达到使因子的主效果得到尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因子中快速有效地筛选出最为重要的几个因子，供进一步优化研究用。•该法不能考察各因子的相互交互作用。淮海工学院海洋学院13部分因子设计法•部分因子设计法与Plackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。•根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。淮海工学院海洋学院14响应面分析（responsesurfaceanalysis，RSM）•方法是数学与统计学相结合的产物，和其他统计方法一样，由于采用了合理的实验设计，能以最经济的方式，用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究，科学地提供局部与整体的关系，从而取得明确的、有目的的结论。•它与“正交设计法”不同，响应面分析方法以回归方法作为函数估算的工具，将多因子实验中，因子与实验结果的相互关系，用多项式近似，把因子与实验结果（响应值）的关系函数化，依此可对函数的面进行分析，研究因子与响应值之间，因子与因子之间的相互关系，并进行优化。淮海工学院海洋学院152发酵过程动力学的基本概念2.1发酵过程的反应描述及速度概念2.2发酵过程动力学研究的基本内容2.3微生物生长动力学的基本概念2.4菌体生长、产物形成、基质消耗动力学的基本概念2.5反应动力学的应用—连续培养的操作特性淮海工学院海洋学院16XS（底物）─→X（菌体）＋P（产物）发酵研究的内容：发酵过程反应的描述菌种的来源——找到一个好的菌种发酵过程的工艺控制——最大限度发挥菌种的潜力2.1发酵过程的反应描述及速度概念淮海工学院海洋学院17基质的消耗速度：dsrdtdsdtX发酵过程反应速度的描述基质的消耗比速：(g.L-1.s-1)(h-1、s-1)单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物（菌体）的量称为比速，是生物反应中用于描述反应速度的常用概念。XS（底物）─→X（菌体）＋P（产物）淮海工学院海洋学院18dsdtX基质的消耗比速：(h-1)菌体的生长比速：dxdtX产物的形成比速：dpdtX(h-1)(h-1)XS（底物）─→X（菌体）＋P（产物）淮海工学院海洋学院19研究反应速度及其影响因素并建立反应速度与影响因素的关联反应动力学模型反应器特性+反应器的操作模型操作条件与反应结果的关系，定量地控制反应过程2.2发酵反应动力学的研究内容淮海工学院海洋学院20已建立动力学模型的类型机制模型：根据反应机制建立几乎没有现象模型（经验模型）：目前大多数模型能定量地描述发酵过程能反映主要因素的影响淮海工学院海洋学院212.3.1微生物在一个密闭系统中的生长情况：时间菌体浓度延迟期指数生长期减速期静止期衰亡期延迟期：dxdt0指数生长期:max倍增时间：td减速期:ddt0静止期：;dxdt0maxXX衰亡期:dxdt02.3微生物生长动力学的基本概念淮海工学院海洋学院222.3.2微生物的生长动力学、Monod方程微生物的生长速度：μ＝f(s,p,T,pH,……,)在一定条件下(基质限制)：μ＝f(S)淮海工学院海洋学院23Monod研究了基质浓度与生长速度的关系———Monod方程(1949)00.20.40.60.811.202004006008001000SVVmVm/2Km00.20.40.60.811.202004006008001000SVVmVm/2KmμmaxsSKSmaxsSvvKS米氏方程:淮海工学院海洋学院2400.20.40.60.811.202004006008001000SVVmVm/2KmmaxsSKSμ：菌体的生长比速S：限制性基质浓度Ks：半饱和常数μmax:最大比生长速度μ单一限制性基质：就是指在培养微生物的营养物中，对微生物的生长起到限制作用的营养物。淮海工学院海洋学院25Monod方程的参数求解(双倒数法)：将Monod方程取倒数可得：111smmSKsmmSKS或：这样通过测定不同限制性基质浓度下，微生物的比生长速度，就可以通过回归分析计算出Monod方程的两个参数。maxsKSS淮海工学院海洋学院26例：在一定条件下培养大肠杆菌，得如下数据：S(mg/l)63364153221μ(h-1)0.060.240.430.660.70求在该培养条件下，求大肠杆菌的μmax，Ks和td?解：将数据整理：S/μ100137.5192.5231.8311.3S63364153221smmSKS淮海工学院海洋学院27μmax，＝1.11(h-1);Ks＝97.6mg/L01002000100200300400/ssm10.9m108.4sktd＝ln2/μmax＝0.64hsmmSKS淮海工学院海洋学院282.4.1初级代谢产物和次级代谢产物次级代谢产物：还有一类产物，对细胞的代谢功能没有明显的影响，一般是在稳定期形成，如抗生素等，这一类化合物称为次级代谢产物。初级代谢产物：微生物合成的主要供给细胞生长的一类物质。如氨基酸、核苷酸等等，这些物质称为初级代谢产物。2.4产物形成动力学的基本概念淮海工学院海洋学院292.4.2Gaden对发酵的三分类与Pirt方程：〖一类发酵〗产物的形成和菌体的生长相偶联xp淮海工学院海洋学院30〖二类发酵〗产物的形成和菌体的生长部分偶联xp淮海工学院海洋学院31〖三类发酵〗产物的形成和菌体的生长非偶联xp淮海工学院海洋学院32〖Pirt方程〗π＝a+bμa=0、b≠0：可表示一类发酵a≠0、b≠0：可表示二类发酵a≠0、b=0：可表示三类发酵淮海工学院海洋学院33SS1菌体S2产物S3维持XS（底物）─→X（菌体）＋P（产物）+维持维持消耗(m)：指维持细胞最低活性所需消耗的能量，一般来讲，单位重量的细胞在单位时间内用于维持消耗所需的基质的量是一个常数。2.5基质消耗动力学的基本概念淮海工学院海洋学院34XS（底物）─→X（菌体）＋P（产物）+维持m:维持消耗系数YP/s:产物对基质的理论得率系数XPssmYYYX/s:细胞对基质的理论得率系数312dsdsdsdsdtdtdtdt物料衡算：淮海工学院海洋学院352.6反应动力学的应用——连续培养的操作特性连续反应器：流入速度=流出速度=F淮海工学院海洋学院36V:反应器内发酵液体积(L)X:反应器内菌体浓度(g/L)So:流加发酵液中基质的浓度(g/L)S:反应器内基质的浓度(g/L)F:补料速度(L/h)淮海工学院海洋学院37物料衡算（连续培养的反应器特性）对菌体:稳态0dxdtdxVxVFxdtxVFxFDV稀释率(D):补料速度与反应器体积的比值(h-1)淮海工学院海洋学院38o物料衡算（连续培养的反应器特性）对基质:稳态0dsdt0dsVFsxVFsdt稀释率(D):补料速度与反应器体积的比值(h-1)0()Dssx淮海工学院海洋学院39D0()sDsxXsYmaxsKSSDμSσx连续培养操作的模型分析↑↑↑↑↓0maxmax0sSKS最大Dμmax时会造成菌体的洗出淮海工学院海洋学院4002468101200.20.40.60.811.2DS,X,DXXSDX连续培养的操作特性淮海工学院海洋学院41连续培养富集微生物的原理连续培养中，最终在此培养体系中生存下来的微生物都是此时刻对该种底物表现出最大生长的微生物（或一个微生物生态）。s0μ当只有B时建立稳态：μB=D,对应S0如果引入微生物A：μ=μA(S0)μADx增加s下降μAμB下降μBD被洗出淮海工学院海洋学院423发酵过程的代谢控制•发酵过程控制是发酵的重要部分•控制难点：过程的不确定性和参数的非线性•同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次会得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素是复杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一般方法对于控制代谢是十分必要的淮海工学院海洋学院433.1发酵过程工艺