4微生物工程第四章发酵工业的无菌技术

第四章发酵工业的无菌技术一、基本概念二、发酵工业污染的防治策略三、发酵工业的无菌技术四、培养基及设备管道灭菌五、空气除菌本章内容灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有生命物质的过程。消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。除菌(degermation):用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。防腐(antisepsis):用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖。一、基本概念消毒与灭菌的区别消毒：表面微生物，只能杀死营养细胞杀菌：所有生命体消毒与灭菌在发酵工业中的应用消毒：发酵车间环境、设备、器具的无菌处理灭菌：培养基等物料的无菌处理（一）污染的危害（二）杂菌污染的防治二、发酵工业污染的防治策略消耗营养；合成非目的产物，菌体自溶、发粘等造成分离困难等；改变体系pH值；杂菌分解目的产物；噬菌体对细菌发酵破坏极大。（一）污染的危害1.染菌的不良后果A．细菌谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。2.染菌危害的具体分析（1）染菌对不同菌种发酵的影响B.霉菌PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无所获。柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。C.酵母菌易污染细菌以及野生酵母菌D.疫苗无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。青霉素：怕染细短产气杆菌链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌柠檬酸：怕染青霉菌肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染常见发酵产品容易污染的杂菌：种子扩大时期染菌灭菌后弃去发酵前期染菌应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种（2）不同发酵时期染菌对发酵的影响发酵中期染菌挽救困难，应早发现，应根据各种发酵的特点和具体情况尽快处理。抗生素发酵输入正常发酵的另一罐发酵液柠檬酸发酵a.污染细菌：加大通风，加速产酸；加入盐酸等条pH3.0以下，抑制细菌b.污染酵母：加入0.025~0.035g/LCuSO4抑制酵母；通风加大，加速产酸。c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下降，黄曲霉自溶。d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。发酵后期污染染菌量不太多，可继续发酵污染严重，则提前放罐杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本；发现后加入，效果要具体评价丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度黏度增加，过滤困难处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀杂菌分泌较多蛋白质杂质时，使水相和溶媒之间极易发生乳化。（3）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响杂质增多，黏度增大，产生泡沫等显微镜检查法平板划线培养或斜面培养检查法肉汤培养检查法发酵过程的异常现象判断溶解氧水平异常变化pH异常变化尾气中CO2异常变化其他异常现象（黏度、泡沫、颜色等）（二）杂菌污染的防治1.染菌的检查与判断12主要原因：①种子带菌②空气带菌③设备渗漏④灭菌不彻底⑤操作失误⑥技术管理不善2.污染原因分析从污染杂菌的种类分析；从污染时间进行分析；从染菌的程度进行分析。污染原因分析方法：（1）种子带菌的防治培养基及器具彻底灭菌避免菌种在移接过程中受污染避免菌种在培养及保藏过程中污染3.杂菌污染的途径及其预防（2）过滤空气带菌及其防治正确选择采气口高处采气、前置粗过滤器设计合理的空气预处理流程减少含油量和湿度设计和安装合理的空气过滤器介质选择（3）设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治设备的渗漏染菌：发酵设备、管道、阀门的破损等而引起的污染。“死角”：蒸汽不能到达预定的灭菌部位或该部位的冷空气不能在加热过程中排净。发酵罐的“死角”管道安装不当或配置不合理形成“死角”常出现“死角”的地方：连接点：法兰、内衬、接口、表头、联轴器、小部件：罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法污水脓疱罐底发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”法兰连接不当造成的“死角”（4）培养基与设备灭菌不彻底的防治（5）操作不当造成染菌（6）噬菌体染菌及其防治①原料性状的影响②灭菌时温度和压力不对③灭菌过程中产生的泡沫造成染菌④连续灭菌维持时间不够或压力波动大⑤灭菌后期的罐压骤变（冷却负压）采取哪些措施能够保持无菌发酵？物料、培养基、中间补料都要灭菌；发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌彻底；好氧发酵通入的空气要除菌；种子无污染；接种无菌操作过关；为了保持发酵的长期无菌状态，需维持一定的正压。三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法干热灭菌法湿热灭菌法射线灭菌法化学药剂灭菌法过滤除菌法火焰灭菌法四、发酵培养基及设备管道灭菌（一）湿热灭菌原理（二）分批灭菌（实罐灭菌）（三）连续灭菌（连消）（四）发酵培养基及设备管道灭菌技术定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，即指微生物在某一特定条件下（温度）的致死时间。相对热阻：指某一微生物在某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。（一）湿热灭菌原理1.微生物的热阻致死温度致死时间在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速度理论，微生物受热死亡的速率-dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N成正比，即：k：比死亡速率常数。k↓，热阻↑,t↑当Nt=0时，t=∞，既无意义，也不可能。一般采用Nt=0.001，即1000次中只有一次失败kNdtdNktNNt0lntNNkt0lg/303.22.湿热灭菌的对数残留定律大肠杆菌在不同温度下的残留曲线嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些微生物芽孢。Nt/N0=kR/(kR-kS)[exp(kst)-ks/kRexp(-kRt)]NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数ND：死亡的芽孢数；N0：初始活芽孢数。kR：耐热性芽孢的比死亡速率；ks：敏感性芽孢的比死亡速率；3.非对数残留定律在T相同时，对数与非对数定律的灭菌时间t不同。微生物死亡与培养物质受热破坏都可看作一级反应：式中C：对热不稳定物质的浓度；k’：分解速度常数；k’的变化也遵循阿累尼乌斯方程：都与相应的活化能及T有关)exp(RTEAk4.灭菌温度和时间的选择CkdtdC'RTEAk'exp(''当T1→T2㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’1(∵ΔEΔE’表4-4p68)∴随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率增加倍数，故一般选择高温快速灭菌（表4-5）。（1）培养基成分营养物质类型油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性。NaCl含量：低浓度（1%-2%）对微生物有保护作用；高浓度（8%-10%以上）减弱微生物的耐热性。5.影响培养基灭菌的其它因素（2）培养基pHpH6.0-8.0，微生物最耐热，pH6.0，灭菌所需时间短（表4-6）。（3）培养基的物理状态灭菌时间：固体培养基液体培养基（4）泡沫泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为不利。（5）培养基中的微生物数量微生物多（芽孢杆菌），灭菌时间长夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽达70℃左右取样管放料管通蒸汽120℃，1×105pa保温保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定罐压接近空气压力向罐内通无菌空气保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门夹套或蛇管中通冷水培养基降温到所需温度（二）分批灭菌（实罐灭菌）1.灭菌工艺过程空气过滤器灭菌并用空气吹干灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，可以简单地利用公式（4-3）粗略估算灭菌所需时间。2.灭菌时间的估算tNNkt0lg/303.2例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在121℃温度下实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2×105个耐热细菌芽孢，已知121℃时灭菌速度常数k=1.8min-1，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。解：N0=40×106×2×105=8×1012(个)Nt=0.001(个)k=1.8(min-1)㏑(Nt/N0)=-ktt=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)]=20.34(min)由于升温阶段就有部分菌被杀灭，实际保温阶段时间比计算值要短。工艺流程喷淋冷却连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程薄板式换热器连续灭菌流程灭菌时间的计算㏑(Ct/C0)=－ktt=2.303/k[lg(C0/Ct)]式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后的含菌数3.连续灭菌（连消）例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为131℃，原污染程度为每1ml含有2×105个杂菌，已知131℃时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。连续灭菌时间的估算解：C0=2×105(个/ml)Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]=2.37min喷淋冷却连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程薄板式换热器连续灭菌流程连续灭菌的优点：高温短时，营养成分破坏少，发酵产率高；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均衡；采用板式换热器时，可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小；可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。分批灭菌与连续灭菌的比较（适用于大型罐）连续灭菌的缺点：对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；蒸汽波动时灭菌不彻底；当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，可防止灭菌不彻底。优点设备投资较少染菌的危险性较小人工操作较方便对培养基中固体物质含量较多时更为适宜分批灭菌的优缺点：缺点营养成分破坏较大灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大。一般只限于中小型发酵装置。1、种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌；2、空气总过滤器和分过滤器灭菌；3、种子培养基实罐灭菌；4、发酵培养基实罐灭菌；5、发酵培养基连续灭菌；6、补料实罐灭菌。4.发酵培养基及设备管道灭菌技术温度维持时间程序空气除菌的必要性好氧发酵需大量空气，空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。五、空气除菌辐射杀菌、加热杀菌、静电除菌、过滤除菌（一）空气除菌方法辐射杀菌：超声波、高能阴极射线，x射线、β射线、γ射线、紫外线(2265Å~3287Å)加热杀菌：加热方法可用蒸汽、电和空气压缩机产生的热量静电除菌：常用于洁净工作台、洁净工作室所需无菌无尘空气的第一次除尘，配合高效过滤器使用。过滤除菌：采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物而取得无菌空气。空气除菌方法流程主要设备：空气压缩机、空气过滤器附属设备：粗过滤器、气液分离器、空气贮罐、空气冷却器（二）空气过滤除菌1.对空气过滤除菌流程的要求根据地理、气候环境和设备条件综合考虑环境污染较重，要考虑改变吸风的条件；温暖潮湿的南方，要加强除水设施；加强消除油雾的污染（压缩机耗油，可采用无油润滑的往复式压缩机）；配备前置粗过滤器及空气贮罐。压缩空气相对湿度φ=50%~60%通过过滤器为好。空气过滤除菌流程的具体要求：空气除菌系统：冷却、分离油水、加热、过滤几种典型的设备流程两级冷却、加热除菌流程冷热空气直接混合式空气除菌流程高效前置过滤空气除菌流程将空气冷却至露点以上的流程利用热空气加热冷空气流程一次冷却和析水的空气过滤流程2.空气除菌流程的分