不同TNM分期恶性肿瘤患者外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的研究

不同TNM分期恶性肿瘤患者外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的研究康文喜樊静王小聪河北省秦皇岛市肿瘤医院邮编：066004摘要：目的探讨不同TNM分期恶性肿瘤患者外周血CD4+CD25+CD127-调节T细胞变化及其临床意义。方法通过流式细胞术动态分析179例恶性肿瘤患者外周血T细胞亚群和CD4+CD25+CD127-调节性T细胞变化。结果不同TNM分期的恶性肿瘤患者在疾病进展过程中外周血CD4+CD25+CD127-细胞占CD4+细胞的比率升高,在肿瘤第Ⅳ期尤其明显(P0.01)；Ⅰ期和Ⅱ期病人CD4+细胞略低于对照组,但差异无显著性意义(P0.05),CD4/CD8比值低于对照组,差异有显著的统计学意义(P0.01)；III、Ⅳ期病人CD4+细胞及CD4/CD8比值均明显减低,差异有显著性意义(P0.01);各期肿瘤患者CD3+、CD8+、CD19+细胞与对照组比较无显著性差异(P0.05)。结论：恶性肿瘤患者外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞占CD4+T细胞比率的升高与恶性肿瘤临床分期密切相关，定期检测外周血中上述指标的变化,有利于了解恶性肿瘤患者的病情变化及预后，下调该比例或许是一种有效的治疗肿瘤的新方法。关键词恶性肿瘤CD4+CD25+CD127-调性T细胞淋巴细胞亚群流式细胞仪CD4+CD25+调节性T细胞（regulatoryTcellTreg）是一类重要的免疫调节细胞，免疫抑制性调节作用是其典型的功能特征，在维持机体免疫平衡、预防自身免疫性反应和疾病的发生中发挥关键作用。研究表明，Treg与肿瘤免疫耐受机制相关，许多肿瘤外周血和肿瘤组织局部调节性T细胞增高[1-12]。本研究利用流式细胞术对比分析不同TNM分期的恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞亚群及Treg变化，探讨其与肿瘤病情及临床转归的关联性。1.材料与方法1.1研究对象179例恶性肿瘤患者为2008年2月至2010年5月本院住院患者，男92例，女87例；年龄36～72岁，平均（52±9.8）岁。所有患者均经病理学证实且不伴有自身免疫性疾病。179例恶性肿瘤中：腺癌44例，黏液癌35例，未分化癌18例，浸润性导管癌82。临床分期：Ⅰ~Ⅱ期67例、Ⅲ期73例、Ⅳ期39例。所有患者近一个月未接受抗肿瘤治疗，近三个月未使用过免疫增强剂。选取同期我院健康体检者30例作为对照组，其中男性16名，女性14例。年龄（48±12）岁。1.2主要试剂及仪器流式细胞仪—EPICSXL为美国贝克曼库尔特公司（BECKMANCOULTER）产品。CD4-FITC、CD8-PE、CD3-PC5、CD19-PE、CD4-PC5、CD25-FITCCD127-PE等荧光标记单克隆抗体、同型对照IgG1或IgG2荧光抗体、红细胞裂解液等试剂均为美国贝克曼库尔特公司出品。1.3实验方法：所有观察对象均于清晨空腹抽取静脉血2ml，EDTA-2K抗凝，使用直接免疫荧光标记法标记细胞并进行流式细胞分析：简言之，根据不同标记组合，取不同荧光标记的单克隆抗体各20μl，加入100μlEDTA-2K抗凝的外周血，室温下孵育15min，再加入红细胞裂解液孵育10min，加入PBS500μl洗两次，离心弃上清，再加入PBS500μl，混匀后上机检测。1.4统计学处理实验结果采用t检验进行统计学分析，统计学差异确定为p＜0.05。2.结果2.1不同TNM分期恶性肿瘤患者外周血调节性T细胞分析：外周血CD4+CD25+CD127-占CD4+T细胞水平明显升高,Ⅳ期患者尤其明显，统计学有显著差异(P0.01)。2.2不同TNM分期的恶性肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群分析：Ⅰ、Ⅱ期患者CD4+阳性细胞比例低于对照组，差异无显著性意义（p﹥0.05）。CD4/CD8比值低于正常组，差异有明显差异（p＜0.05）；Ⅲ期和Ⅳ期患者外周血CD4+、CD4/CD8比例均明显降低，差异有显著性意义（p＜0.01）；各期患者CD3+、CD8+、CD19+细胞亚群与对照组无显著性差异（p﹥0.05）。表1不同TNM分期恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞群分析（.x±s）注:与正常对照组比较*P0.05；**P0.013.讨论调节性T细胞(regulatoryTcell，Treg)是一类具有免疫抑制作用的T细胞，来源于胸腺、表达IL-2受体α链[1]、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-inducedTNFreceptor）、GITR和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原－4（cytotoxicTlymphocyteassociatedantigen-4，CTLA-4）、还表达一种独特的细胞核内蛋白-Foxp3。Treg能抑制免疫反应,防止自身免疫的发生,诱导免疫耐受。研究证实,Treg在生理和病理状态下均有重要的免疫调节作用[2,3]。Treg细胞具有低反应性与免疫抑制性两大功能特征。在体内发挥免疫调节、维持自身免疫耐受中发挥着决定性作用，其数量、定位及功能的异常与机体的自身免疫性疾病、慢性炎性反应以及肿瘤的发生有密切的关系。分组NCD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+CD19+、CD4+CD25highCD127-占CD4+T%对照3072.03±90.342.56±9.6527.50±6.661.92±0.3010.67±6.164.14±0.85ⅠⅡ期6768.55±13.5038.50±13.9927.56±8.451.60±0.65*10.04±6.574.04±0.70Ⅲ期7368.55±12.0434.65±7.52**8.85±8.961.06±0.63**10.23±7.804.22±0.82**Ⅳ期3968.50±7.8936.02±8.06**29.56±9.050.84±0.33**10.06±9.015.87±1.68**CD4+CD25+调节性T淋巴细胞在肿瘤细胞的免疫耐受中有重要作用。其数量的增多与肿瘤恶性程度呈正相关，并且预示肿瘤的预后较差。本研究发现，CD4+T细胞亚群在不同临床分期的恶性肿瘤患者中，也有不同程度抑制，并有CD4/CD8比值下降，结果与文献报道的一致。有文献报道，恶性肿瘤患者外周血中CD4+CD25+调节性T淋巴细胞数量明显增多，CD4+CD25+Treg水平占CD4+T细胞百分比可达正常人的一倍以上。本组检测结果，Ⅲ、Ⅳ期恶性肿瘤患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞水平明显高于Ⅰ-Ⅱ期恶性肿瘤患者；进展期（Ⅳ期）恶性肿瘤肿瘤患者，外周血的CD4+CD25+CD127-Treg细胞水平明显升高。结果显示，恶性肿瘤患者外周血调节T细胞比例的增加与肿瘤的临床分期密切相关。Ⅲ、Ⅳ期患者外周血调节性T细胞水平高于Ⅰ+Ⅱ期患者，而且进展期（Ⅳ期）肿瘤患者其外周血的调节性T细胞水平明显升高，这一现象说明恶性肿瘤患者免疫功能失调与外周血调节T细胞比例增加有关，可能直接参与肿瘤进展的全过程，与外周血Treg细胞水平低者相比，外周血调节性T细胞水平高者其预后较差。本研究还发现不同临床分期的恶性肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群失衡，CD4+亚群和CD4/CD8比值明显降低，而且Ⅲ、Ⅳ期患者CD4+CD25+CD127-调节性T细胞明显增高，提示恶性肿瘤患者免疫失衡和免疫耐受增强。动态观察恶性肿瘤患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg比例变化,对恶性肿瘤预后的判断有参考意义。近年来关于CD4+CD25+Treg细胞的研究已经引起了免疫学界高度重视并取得了令人瞩目的新进展。相信在不远的将来，在体内外有效的诱导、扩增和控制CD4+CD25+Treg细胞，将为自身免疫病、肿瘤等治疗开辟新的思路。参考文献1.SakaguchiS,SakaguchiN,AsanoM,ItohM,TodaM.Immunologicself-tolerancemaintainedbyactivatedTcellsexpressingIL-2receptoralpha-chains(CD25).Breakdownofasinglemechanismofself-tolerancecausesvariousautoimmunediseases.JImmunol1995;155:1151-11642.ReadS,MalmstromV,PowrieF.CytotoxicTlymphocyte-associatedantigen4playsanessentialroleinthefunctionofCD25(+)CD4(+)regulatorycellsthatcontrolintestinalinflammation.JExpMed2000;192:295-3023.HoriS,NomuraT,SakaguchiS.Controlofregula-toryTcelldevelopmentbythetranscriptionfactorFoxp3.Science2003;299:1057-1061[4]刘莉,丁乾,曹如波,等恶性肿瘤患者外周血CD4+CD25+调节T细胞的检测及其临床意义[J]临床肿瘤学杂志,2005,10(4):342—345.[5]TerabeM,BerzofskyJA.ImmunoregulatoryTcellsintumorimmunity[J].CurrOpinImmunol,2004,16(2):157-162.[6]WolfAM,WolfD,SteurerM,etal.IncreaseofregulatoryTcellsintheperipheralbloodofcancerpatients[J].ClinCancerRes,2003,9(2):606-612.[7]SasadaT,KimunreM,YoshidaY,etal.CD4+CD25+regulatoryTcellsinpatientswithgastrointestinalmalignanciespossibleinvolvementofregulatoryTcellsindiseaseprogression[J].Cancer,2003,98(5):1089-1099.[8]UnittE,RushbrookSM,MarshallA,etal.Compromisedlymphocytesinfiltratehepatocellularcarcinoma:theroleofT-regulatorycells[J].Hepatology,2005,41(4):722-730.[9]SassdaT,KimuraM,YoshidY,etal.CD4+CD25+regulatoryTcellsinpatientswithgastrointestinalmalignancies:possibleinvolvementofregulatoryTcellsindiseaseprogression[J].Cancer,2003,98(5):1089-1099.[10]IchiharaF,KonoKTakahashiA,et,al.IncreasedpopulationsofregulatoryTcellsinperipheralbloodabdtumor-infiltratinglymphocytesinpatientswithgastricandgastricandesophagealcancers[J].ClinCancerRes,2003,9(12):4404-4408.[11]DelongPCarrollRG,HenryAC,etal.RegulatoryTcellsandCytokinesinMalignantPleuralEffusionsSecondarytoMesliomaandCarcinoma[J].CancerBiolTher,2005,4(3):342-346.[12]OrmadyLA,HillemannT,WedemeyerH,rtal.Increas