专题一二三发酵技术微生物培养植物组培

C6H12O6＋2O2—→2CH3COOH＋2CO2＋2H2O专题一传统发酵技术的应用课题一果酒和果醋的制作发酵：利用微生物或其他生物细胞在有氧或无氧条件下繁殖或积累其代谢产物的过程。类型：（1）根据是否需要氧气分为：需氧发酵和厌氧发酵。（2）根据产生的产物可分为：酒精发酵、乳酸发酵、醋酸发酵等1．酵母菌的细胞呼吸酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖：C6H12O6+6H2O+6O2→6CO2+12H2O+能量酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2+能量2．酵母菌发酵的最佳环境:酵母菌在有氧和无氧的条件下都能生活有氧呼吸时，产生能量多，可大量繁殖，但起不到发酵效果；无氧呼吸时，产生能量少，仅能满足自身代谢，繁殖速度减慢，此时可以进行发酵；在利用酵母菌发酵时最好是先通入无菌空气在有氧环境下使其繁殖，再隔绝氧气进行发酵。20℃左右最适合酵母菌繁殖，酒精发酵的最佳温度是在18℃～25℃，pH最好是弱酸性。3．醋酸菌好氧性细菌，当缺少糖源时和有氧条件下，可将乙醇（酒精）氧化成醋酸。表达式为：C2H5OH+O2→CH3COOH+H2O；当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。醋酸菌生长的最佳温度是在30℃～35℃装置各部位的作用充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。排气口：排出酒精发酵时产生的CO2。出料口：是用来取样的。与瓶身相连的长而弯曲的胶管：加水后防止空气中微生物的污染。该装置的使用方法：使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。流程每天抽取定量发酵液与重铬酸钾液做检测并观察颜色：酸性条件下会生成灰色物质。几种常用发酵菌种的比较菌种项目酵母菌醋酸菌毛霉乳酸菌生物学分类真核生物原核生物真核生物原核生物代谢类型异养兼性厌氧异养需氧异养需氧异养厌氧酶酶酶挑选新鲜的水果(如葡萄)→冲洗→榨汁→酒精发酵→醋酸发酵果酒果醋繁殖方式适宜条件下出芽生殖二分裂生殖孢子生殖二分裂生殖生产应用酿酒酿醋制作腐乳制作泡菜发酵条件前期需氧，后期不需氧一直需氧一直需氧不需氧果酒、果醋、腐乳、泡菜制作中所用菌种及控制条件的比较制作内容比较项目果酒果醋腐乳泡菜所用菌种酵母菌醋酸菌主要是毛霉乳酸菌控制条件O2的有无无氧有氧有氧无氧最适温度18℃～25℃30℃～35℃15℃～18℃常温时间控制10～12天7～8天腌制8天左右腌制10天左右其他条件封闭充气口适时充气控制盐酒用量控制盐水比例深化拓展：1、由于醋酸菌和乳酸菌属于原核生物，因此在利用这两类微生物时，其环境中一定不要加入青霉素等抗生素。2、在葡萄酒自然发酵的过程中,起主要作用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌.在发酵过程中,随着酒精浓度的提高,红葡萄皮的色素也进入发酵液,使葡萄酒呈现深红色.在缺氧呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。3、控制醋酸发酵条件的作用①氧气。③温度。课题二腐乳的制作1、多种微生物如青霉、酵母、曲霉、毛霉参与了豆腐的发酵，起主要作用的是毛霉。毛霉是一种丝状真菌。代谢类型是异养需氧型。生殖方式是孢子生殖。营腐生生活。2、原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。3、实验流程：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制4、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。前期发酵的主要作用：1.创造条件让毛霉生长。2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。5、将豆腐切成若干块。豆腐的含水量为70％左右，水分过多则腐乳不易成形。·毛霉的生长条件：将豆腐块平放在笼屉内，控制在15～18℃。来源：1.来自空气中的毛霉孢子，2.直接接种优良毛霉菌种时间：5天·加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。腌制为8天。·用盐腌制时，注意控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味·食盐的作用：1.抑制微生物的生长，避免腐败变质2.析出水分，是豆腐变硬，在后期制作过程中不易酥烂3.调味作用，给腐乳以必要的咸味4.浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。·配制卤汤：卤汤是由酒及香辛料配制而成的。酒的含量一般在12%左右。·酒的作用：1.防止杂菌污染以防腐2.与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味3.酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。·香辛料的作用：1.调味作用2.杀菌防腐作用3.参与并促进发酵过程·防止杂菌污染：①玻璃瓶洗刷干净后要用沸水消毒。②装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好豆腐、加卤汤后，注意密封好，防止瓶口被污染。课题三制作泡菜·制作泡菜所用微生物是乳酸菌，其代谢类型是异养厌氧型。在无氧条件下，降糖分解为乳酸。分裂方式是二分裂。反应式为：C6H12O6酶2C3H6O3+能量含抗生素牛奶不能生产酸奶的原因是抗生素杀死乳酸菌。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生产酸奶。·亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，国家规定肉制品中不超过30mg/kg，酱腌菜中不超过20mg/kg，婴儿奶粉中不超过2mg/kg。亚硝酸盐被吸收后随尿液排出体外，但在适宜pH、温度和一定微生物作用下形成致癌物质亚硝胺。·一般在腌制10天后亚硝酸盐含量开始降低，故在10天之后食用最好.*测定亚硝酸盐含量的原理是在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，与已知浓度的标准显色液目测比较，估算泡菜中亚硝酸盐含量。2、微生物的实验室培养1、培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。亚硝酸盐含量发酵时间（d）2、培养基按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作常用的凝固剂，但不止这一种凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。培养基的分类和应用划分标准培养基种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动、分类、鉴定固体培养基加凝固剂，如琼脂微生物分离、鉴定、活菌计数化学组成天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确（用化学成分已知的化学物质配成）分类、鉴定目的用途选择培养基培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物5、培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子（部分微生物需要）。6、碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。7、氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）。只有固氮微生物才能利用N2。8、培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件9、无菌技术：获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。要注意以下几个方面：①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。10、消毒与灭菌的区别比较消毒灭菌条件使用较为温和的理化方法使用强烈的理化因素结果杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子适用实验操作的空间、操作者的衣服和手微生物的培养器皿、接种用具和培养基等常用方法煮沸消毒法（如在100℃，煮沸5～6min）、巴氏消毒法（如在80℃，煮15min）；使用酒精、氯气、石炭酸等化学药剂进行消毒灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌三种常用灭菌方法的比较灭菌方法灭菌条件灭菌时间适用材料或用具灼烧灭菌酒精灯火焰的充分燃烧层直至烧红接种环、接种针或其他金属工具干热灭菌干热灭菌箱内，160～170℃1～2h玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等高压蒸汽灭菌100kPa，121℃15～30min培养基等制作牛肉膏蛋白胨固体培养基（1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。（熔化之后灭菌之前往往需要调节PH）确定培养基制作是否合格的方法：将未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。纯化大肠杆菌（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。分为稀释操作和涂布平板操作两步。（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。微生物计数方法1、显微镜直接计数法，利用计数板在显微镜下计数。2、活菌计数法，在稀释度足够高的菌液中聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，形成单个菌落，选择菌落数在30-300之间的平板计数。菌落数比活菌实际数低，因为当两个或多个连在一起时，平板上只观察到一个菌落。统计结果用菌落数来表示。3、滤膜法，饮用水过滤后，滤膜放在伊红美蓝培养基上培养，计数黑色大肠杆菌菌落。菌种的保存（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。①临时保藏方法：试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。菌落长成后，放入4℃的冰箱中保藏。（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。课题二土壤中分解尿素的细菌的分离与计数①筛选菌株：利用选择培养基筛选菌株。②测定微生物数量的常用方法：稀释涂布平板法和显微镜直接计数。③土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布平板→微生物的培养与观察→挑选菌落尿素：是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌能合成脲酶将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。尿素分解菌的分离：尿素分解菌能合成脲酶将尿素分解成氨。氨使培养基的PH升高。以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养尿素分解菌，指示剂变红色。筛选菌株（1）实验室中微生物的筛选应用的原理:人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。这就是选择培养基。（2）配制选择培养基的依据：根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。实验设计：（1）土壤取样：（2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板