不同桤木根瘤内生菌的分离培养及生物学特性

第30卷第7期Vo.l30No.72010年7月JournalofCentralSouthUniversityofForestry&TechnologyJu.l2010:2010-01-05:国家/十一五0林业科技支撑项目:周德明(1964-),男,湖南祁东人,副教授,博士研究生,主要从事微生物教学与科研工作,(中南林业科技大学,湖南长沙410004):用根瘤切片法和根瘤均浆法,从四川桤木和台湾桤木根瘤中分离出2株根瘤内生菌,并对其形态观察、生理类型和生物学特性进行研究。结果表明:菌株AC0812S009和AC0812T017的形态特征、生理类型和生物学特性相似。菌株具有典型的弗兰克氏菌菌丝体形态,初步判定为弗兰克氏菌,菌株生理类型为B型,最佳培养条件)))碳源为吐温)80,pH值为7.0,培养温度为28e。:微生物学;桤木;根瘤;内生菌;弗兰克氏菌:Q93-3;S792.14:A:1673)923X(2010)07)0078)07IsolationandbiologicalcharacteristicsofFrankiastrainsfromdifferentkindsofAlnusZHOUDe2ming,LIYao(CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha410004,Hunan,China)Abstract:TwostrainsofFrankiawereisolatedfromrootnodulesofAlnuscremastogyneandA.formosanabynodulesectioningandhomogenate.Theresultsofthemorphologica,lphysiologicalandbiologicalcharacteristicsstudyshowthatcolonymorphol2ogyandbiologicalcharacteristicsofstrainAC0812S009aresimilarwithstrainAC0812T017.ThestrainshasthetypicalFrankiamyceliummorphology.ThestrainsarepreliminaryidentifiedasamemberofFrankia.ThephysiologicaltypeofthestrainsareB2type.Thebestconditionofculture(optimum)carbonistween280,theoptimumpHis7.0,theoptimumtempera2tureis28e.Keywords:microbiology;Alnus;rootnodule;endophytes;Frankia弗兰克氏菌(Frankia)是一类能在非豆科植物根部形成根瘤而进行共生固氮作用的放线菌[1]。其具有很强的共生固氮能力,且分布广,是陆地生态系统中重要的氮供给者,因而在农业和林业上具有广泛的应用前景。Frankia的分离工作始于20世纪初,限于当时的技术水平,直至1978年Calla2ham等从香蔽木根瘤中分离出弗兰克氏菌并成功进行了离体培养,Frankia的研究工作才有较大的进展。到目前为止,国内外己从杨梅、沙棘、木麻黄等不同放线菌结瘤植物根瘤中分离到内生菌纯培养物,但对从四川桤木Alnuscremastogyne和台湾桤木A.formosana中分离Frankia菌株的研究报道甚少,且不系统。笔者于2009年从汨罗林业科技示范园四川桤木和台湾桤木根瘤中成功地分离到2株根瘤内生菌,并对其形态特征、生理类型和生物学特性进行了系统的研究,初步确定该菌的分类地位及其特性,旨在为Frankia在促进桤木结瘤,提高固氮活性以及促进桤木生长方面的应用提供理论依据。第7期周德明,等:不同桤木根瘤内生菌的分离培养及生物学特性11.1于2008年~2009年先后在汨罗采集了四川桤木和台湾桤木的根瘤作为实验材料。样地基本情况见表1。1、Table1Hostsofstrainsandgrowthsituation供试材料采集地点生境根瘤汨罗林业科技示范园人工林树龄土壤类型pH值7年生红壤6.31.2(1)JanBlom和Akkermans,简称JA培养基(g/L)[4]KH2PO40.3,NaH2PO40.2,MgSO4#7H2O0.2,KCl0.2,吐温801.0,酪蛋白水解物1.0,葡萄糖10.0,琼脂粉18.0,维生素B1、B2、B6、生物素、烟酸各0.1mg,盐酸硫胺0.05,核黄素0105,柠檬酸铁(1%)1mL,微量元素液1mL,pH值为6.8。(2)DSM培养基(g/L)[4]琥珀酸钠5.0g,CaCl2#2H2O0.1g,KH2PO4618g,NH4Cl0.43g,MgSO4#7H2O0.2g,微量元素1mL,FeNaEDTA0.5mL,维生素类2mL,pH值为6.8。FeNaEDTA:FeSO4#7H2O10mg/mL,NaEDTA2mg/mL和Na2MoO40.15mg/mL(3)NAZS培养基(g/L)[4,8]KH2PO40.5,MgSO4#7H2O0.2,CaCl2#2H2O0.1,酪蛋白水解物5.0,FeNaEDTA1mL,JA微量元素1mL,pH值为6.8。1.31.3.1根瘤内生菌的分离根瘤切片法[5]:新鲜的根瘤,小心除去表面污染物和土粒,尽量不使根瘤表面破损。用解剖刀将大根瘤分成小的瘤簇或单瓣瘤,用自来水洗净。将洗净根瘤移入灭菌的培养皿中,以95%酒精浸泡30~60s,然后0.1%HgCl2表面灭菌5~10min,用无菌水冲洗数次。在灭菌培养皿中用无菌解剖刀将根瘤切成1~2mm大小的薄片,用无菌镊子或解剖刀移入JA培养基中。根瘤均浆法[5]:采用与切片法相同的方法清洗根瘤表面,去皮并加入少量无菌水,用玻璃研磨器将瘤瓣研碎,取一定均浆在JA培养基上划线。置恒温箱中,28e静置培养。观察培养基中菌丝体的生长状况,并不断淘汰污染菌。纯化培养,观察生长和色素的产生状况。1.3.2形态观察观察培养基中菌落生长的形态,并在光学显微镜下观察菌株形态特征,对菌株进行初步判定。1.3.3生理类型检测生理类型划分根据Lechevelier方法[6-8],将经预培养的菌株分别接种于以下6种培养基培养基中:¹NAZS基础培养基,记为S;ºS+1%葡萄糖,记为10S;»S+2%葡萄糖,记为20S;¼S+0.2%吐温-80,记为T+S;½5+0.2%吐温-80+1%葡萄糖,记为T+10S;¾S+0.2%吐温-80+2%葡萄糖,记为T+20S。28~30e暗处静置培养,并分别于第2、4、6周测定菌丝体蛋白质在595nm下的OD值,根据菌株生长变化划分其生理类群。如吐温)80抑制菌株生长的为生理A型,促进菌株生长的为生理B型,对菌株生长没有影响的为生理AB型。每组处理做3个重复。1.3.4生物学特性实验1.3.4.1碳源试验在不含碳源的DSM培养基中分别添加1%的可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、吐温)80,观察菌株生长情况,离心收集菌丝体,测干重。每组处理做3个重复。1.3.4.2耐盐能力的测定以DSM为基础培养基,分别添加浓度为1%、2%、3%、4%的NaC,l灭菌后,接入等量的菌体,28~30e恒温培养14d,离心收集菌丝体,测干重。每组处理做3个重复。1.3.4.3pH值对根瘤内生菌生长情况的影响以DSM培养基为基础,通过1mol/LH2SO4和NaOH调节培养基pH值,分别制备pH值为6.5、710、7.5、8.0的4种培养基。在这4种培养基中分别接种供试菌株,重复3次,28e下培养14d,离心79中南林业科技大学学报第30卷收集菌丝体,测干重。每组处理做3个重复。1.3.4.4温度对根瘤内生菌生长情况的影响将供试菌种接于DSM培养基,设置26、28、30、32e4个温度条件进行培养,重复3次,培养14d时观察菌落生长情况。离心收集菌丝体,测干重。每组处理做3个重复。1.3.5培养基最佳条件优化碳源、pH值、温度、盐度是菌体在培养基中生长的主要影响因素,本实验将这4因素在4个不同的水平下进行正交实验,以确定菌株最佳的培养条件。实验设计如表2所示。244Table2DesignoforthgonaltestL16(44)实验号碳源pH值温度/e盐度(因素1)(因素2)(因素3)(因素4)11(可溶性淀粉)1(6.5)1(26)1(0)212(7.0)2(28)2(1%)313(7.5)3(30)3(2%)414(8.0)4(32)4(3%)52(蔗糖)12362214723418243293(葡萄糖)134103243113312123421134(吐温)80)142144231154324164413按照实验设计完成每一号实验,以菌丝体干重最大作为择优指标,通过DPS数据处理软件对结果进行分析[9],得到最佳培养条件。22.16年生四川桤木瘤簇近似球形,呈珊瑚状,黄褐色,根瘤内部呈乳白色,接触空气后变黄。根瘤由多重二分叉的瘤瓣组成,瘤瓣棒状,生长多年的根瘤由于分叉的增多,能形成球状瘤簇,直径可达4~5cm,可将根部环绕一圈。详见图1、图2。6年生台湾桤木根瘤簇形状不规则,呈珊瑚状,16Fig.1Six2year2oldrootnodulesofAlnuscremastogyne26Fig.2Six2year2oldnodulespetalsofAlnuscremastogyne红褐色,死根瘤呈黑褐色。根瘤多重二分叉,瘤瓣短粗,环绕根部。详见图3、图4。36Fig.3Six2year2oldrootnodulesofAlnusformosana46Fig.4Six2year2oldnodulespetalsofAlnusformosana80第7期周德明,等:不同桤木根瘤内生菌的分离培养及生物学特性2.2内生菌在固体培养基上生长1周左右出现菌落,沿根瘤切片或划线部位形成的菌落质地坚硬、紧密、乳白色、呈放射状和凸起状,如图5、图6所示。在液体培养基内生长较快,4~5d沿根瘤切片出现白色絮状菌落或分散在底部生长,培养基不浑浊。详见图7、图8。5Fig.5Strainsgrowingaroundslicesofrootnodules6Fig.6Strainsgrowingalongpositionoflineation7Fig.7Strainsgrowingalongpositionoflineation8Fig.8Strainsgrowingaroundslicesofrootnodulesinliquidmedia经过初筛、复筛和纯化,最终得到2株桤木根瘤内生放线菌(AC0812T017,AC0812S009),分别来自6年生台湾桤木和四川桤木,由于没有进行分子鉴定,尚不能判断是否为同种弗兰克氏菌。2.3将菌株置于光学显微镜观察其菌丝体形态特征(见图9、图10)表明,菌株具有典型的弗兰克氏菌菌丝体形态:即菌丝无色素,有明显分枝,粗细不均,具有菌丝、孢囊和泡囊等特征性结构。根据国际上公认的弗兰克氏菌属的定义,在形态特征方面的描述为/内生菌纯培养呈放线菌样,在液体培养中产生不动孢子的孢囊,有可能形成泡囊0,初步断定应属于弗兰克氏菌的成员[10]。9AC0812T017(@1500)Fig.9ReproductivetorulosehypheproducedbyAC0812T01710AC0812S009(@1500)Fig.10IrregularsporangiaformedinAC0812S0092.4Lechevalier根据Frankia能否利用吐温)80而将其分成2个亚群,即生理A型和生理B型。生理A型:吐温)80的存在抑制菌株对葡萄糖的利用;生理B型:吐温)80的存在促进菌株对葡萄糖的利用。由表3、表4可知:菌株AC0812T017和AC0812S009在无吐温)80的培养基中不能利用葡81中南