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利用微生物全细胞方法通过α-羟基化2-苯乙酸衍生物和还原α-酮酯制备互为对应异构体的（S）和（R）-扁桃酸衍生物摘要：利用不同分类群的41种微生物通过对映选择法还原苯甲酰甲酸甲酯得到（R）-扁桃酸甲酯，对映体变量中等偏高。相反，长蠕孢菌中的单加氧酶CIOC3.3316催化羟基化的2-苯乙酸甲酯得到（S）-扁桃酸甲酯。这种氧化和还原生物转化的结合提供了一种制备手性α-羟酸衍生物对映体的方法。一、简介由于对不对称合成兴趣的逐渐增加，促进了在有机合成中生物转化方面取得了很大的进展，并且已经广泛的用于手性化合物的合成中。光学纯的α-羟酸及其衍生物是合成大量不同生物活性分子和其他精细化学药品的重要的基础。此外，扁桃酸和其衍生物已经发现是手性拆分过程中药物制剂和拆分剂的万能媒介物。由于对这些化合物产生了浓厚的兴趣，以开发了几种方法用来得到其光学纯形式。包括，动态拆分外消旋的α-羟酸酯，水解cyabohydrin以及还原前手性的α-酮酯。然而，扁桃酸甲酯和其衍生物很难从他们对应的前手性芳香族的羧基诱导剂通过C-H氧化得到。区域和立体选择的羟基化2-苯乙酸衍生物是制备有旋光性的扁桃酸衍生物最简单的途径。然而，在合成化学中区域和立体选择羟基化有活性的C-H仍然是一个挑战。除此之外，羟化反应可能是这类转化的一种有效途径。Adma等人报道，α-氧化的长链羧酸通过豌豆中的氧化酶作用得到有旋光活性2-羟酸。目前，Arnold等人首次利用设计的细胞色素P450BM-3对映选择氧化1形成（S）-2；然而，设计过的细胞色素P450BM-3与2-苯乙酸的的反应收率中等偏低并且对映体过量中等偏高（82-90%）。Holland小组报道与长蠕孢菌NRRL4671作用的长链链腈（C6-C10）后可得到低产量的（R）-2-链烯醇（8-19%）并且有很高的光学纯度（ee95%）。在这当中，我们报道了一种微生物菌株（长蠕孢菌CIOC3.3316）使2-苯乙酸甲酯通过羟基化作用生成（S）-扁桃酸甲酯，并且有很高的对映选择性（92%ee）。此外，这篇文献中同样报道了对一些可以还原苯甲酰甲酸甲酯生成（R）-扁桃酸甲酯微生物进行的研究。这种氧化和还原生物转化的结合提供了一种制备手性α-羟酸衍生物对映体的方法。（图1）二、结果与讨论2.1氧化从表1显示的结果来看，长蠕孢菌CIOC3.3316对（S）-构型有很强的立体选择性。菌株（1，3-5）呈现出很低的活性或者没有活性。然而，长蠕孢菌CIOC3.3316的对扁桃酸甲酯的产率却达到62%并且对映体过量为92%（菌株2）。目前，Arnold等人首次利用设计的细胞色素P450BM-3（BM-3从大地懒属杆菌中分离得到）对映选择氧化1形成（S）-2（90%对映体过量），其能够对映选择在某一羧基和肽基团的α-位发生羟基化作用。相比Arnold等人的研究，我们采用野生菌株（长蠕孢菌CIOC3.3316）作为生物催化剂，同时（S）-2由休眠的全细胞制备，对映体过量为92%。另外，全细胞发酵提供了个不同的方法克服辅助因子阻碍：这种阻碍是因为活体总是提供自然循环时所需要的所有要素。因此可以避免蛋白质提纯这个繁琐的过程，并且也不被酶可能有的不稳定性的所限制。多数情况下，细胞的培养和贮存是很容易的，因此代表这个催化实体是可恢复的资源。我们研究组发现微生物菌株的全细胞（长蠕孢菌CIOC3.3316）表现出像生物催化剂一样的高的羟化酶的活性，将组成一个新的微生物羟基化系统。反映条件，电子和立体作用与芳香族和脂肪族羧酸酯区域及对映选择的羟基化作用之间的相互关系也在研究中。2.2还原表2中概述了对发生还原反应的微生物进行筛选的结果。对41种微生物菌株还原产率的评估，其中10种菌催化还原酮酯3生成相应的羟基酸酯4，产率很高（90%，菌株3-12）；这其中的6种菌（念珠地丝菌CIOC2.616,念珠地丝菌CIOC2.1062,念珠地丝菌CIOCSY1,酿酒酵母CIOC2.1396,YarrowialipolyticaCIOC2.1506）还原酮酯1生成相应（R）-扁桃酸酯，对映选择性高（对映体过量90%-95%，菌株3-5，7，9，11）。对于立体选择，八种菌（毛孢子菌CIOC2.25,念珠地丝菌CIOC2.1080,念珠地丝菌CIOC2.616,念珠地丝菌CIOC2.1062,念珠地丝菌CIOCSY1,酿酒酵母CIOC2.1396,YarrowialipolyticaCIOC2.1506）遵循“Prelog原则”生成（R）-扁桃酸盐，并且没有任何一种菌株表现出反Prelog特异性生成（S）-扁桃酸盐。这些结果符合“Prelog原则”。这个简单的模型说明大部分的脱氢酶将氢阴离子传递到前手性酮酯的背面。念珠地丝菌CIOC2.616被选做是进一步准备合成（R）-扁桃酸甲酯最好的菌种。三、结论扁桃酸甲酯的对映体通过还原苯甲酰甲酸甲酯和氧化2-苯乙酸甲酯得到。一些菌株催化苯甲酰甲酸甲酯的对映选择的还原反应有很高的转化率，并且得到光学纯的（R）-扁桃酸甲酯。另外，以证明长蠕孢菌CIOC3.3316可以使2-苯乙酸甲酯发生羟基化反应生成（S）-扁桃酸甲酯。羧酸酯α-位的对映选择的羟基化反应提供了一种新的微生物全细胞反应类型，并且拓展了一条生成（S）-扁桃酸衍生物的新路线。更重要的是，这是在没有溶剂条件下利用微生物细胞直接合成（R）或者（S）-扁桃酸甲酯的重大进展。总之，这将会促进绿色可持续合成法的发展。四、实验4.1概述除非特殊说明，所用的试剂均是购买后直接使用，没有经过进一步纯化。化合物1，化合物3，对照品和（R）-扁桃酸甲酯是从Aldrich化学公司购买。TLC采用的是硅胶玻璃板。柱层析采用硅胶G（200-300目）为固定相，乙酸乙酯/石油醚为流动相。1H和13CNMR谱由Brucker-300（300/75MHz）波谱测定仪记录，CDCl3为溶剂，TMS为内标物。4.2微生物的培养筛选的微生物保存在本实验室中。酵母菌在含有0.2%(w/v)葡萄糖，2%(w/v)胨，1%(w/v)酵母菌提取液（pH6.8-7.0）的介质中生长；细菌在含有0.1%(w/v)氯化钠，0.5%(w/v)牛肉膏，2%(w/v)胨(pH6.8)的溶液介质中生长；真菌在含有2%（w/v）葡萄糖的马铃薯上生长。菌株保存在4oC的琼脂斜面上。取锥形瓶，每个装有适量的100ml已灭菌的培养液，接种供试菌，在定轨摇床（160rpm）28oC进行培养。酵母菌、细菌培养48小时，真菌培养72小时后，离心分离细胞，并用冷的生理盐水洗两次。4.3微生物筛选的特定程序将微生物细胞混悬液（酵母菌、细菌、真菌）置于10ml50Mm的磷酸氢二钾缓冲液（Ph7.0）中，分别加入苯甲酰甲酸1（0.1mmol）,或者2-苯乙酸甲酯3（0.1mmol）。将反应混合物置于定轨摇床(160rpm)上30oC培养24h.在通过8000g离心机离心8分钟，取上层溶液用NaCl饱和，再用乙酸乙酯萃取三次。通过GC或者HPLC分析法测定产物的产率以及对映体过量。4.4产物的分离及鉴定2-苯乙酸甲酯和苯甲酰甲酸甲酯经过24小时的生物转化，分别各生成300mg(2.0mmol)和328mg(2.0mmol)产物。产物经乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩。原始的反应混合物用快速色谱法（25%乙酸乙酯/石油醚）纯化。这样得到的产量分别是209mg(1.42mmol)和268mg(1.61mmol)，产率62-81%。浓缩的样品上HPLC进行分析，测定光学纯度。（S）-扁桃酸甲酯[α]20D=+130.2(c0.8,甲醇)，（R）-扁桃酸甲酯[α]20D=+135.6(c1.0,甲醇)。扁桃酸甲酯的氢谱碳谱如下所示：1HNMR(CDCl3,300HZ)中：δ3.45(s,1H),3.76(s,3H),5.18(s,1H),7.37–7.40(m,5H)。13CNMR(CDCl3,75Hz)中:δ174.0,138.2,128.5,128.4,126.6,72.8,53.0。4.5测定产物构型的对映体过量产物的绝对构型通过手性HPLC利用已知的（R）-2或者(S)-2作为标准品已经测出。通过2-苯乙酸甲酯和苯甲酰甲酸甲酯生物转化生成的产物通过利用手性柱的HPLC进行分析。手性柱OD-H(u0.46cm*25cm)购自日本的Daicel公司。已烷/异丙醇（90:10）作为流动相，1ml/min，在254nm波长出进行检测。互为外消旋的扁桃酸甲酯的保留时间分别为11.53min和13.11min。致谢感谢国家自然科学基金会对我们经济上的支持（No.20672110）。