《分子生物学检验技术课件》核酸的基本结构和功能

第二讲核酸的基本结构和功能分子生物学实验室《分子生物学检验技术》课件1868年，F.Miescher从细胞核中分离得到一种酸性物质，现在被称为核酸。核酸是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。一、核酸是什么？1944年，Avery的转换转化实验orand可分离1952年，噬菌体感染大肠杆菌试验。以上两个试验证明了DNA是遗传物质，物种的所有特征都编码在DNA分子中。以后又发现了RNA病毒，它们的遗传信息编码在RNA分子中。有人说：给我一个爱因斯坦的细胞，我就可以克隆出许许多多的爱因斯坦。--一个细胞中含有这种生物所有的遗传信息。二、核酸有多少种？两种：1.DNA2.RNADNA---DeoxyribonucleicAcid----脱氧核糖核酸RNA---RibonucleicAcid---------核糖核酸稍后讲核酸的组成时将看出DNA和RNA的区别和联系。三、核酸在哪里？98％核中（染色体中）真核线粒体（mtDNA）核外叶绿体（ctDNA）DNA拟核原核核外：质粒（plasmid）病毒：DNA病毒因此：1.要从有核细胞中提取DNA。2.一般我们从有核细胞的细胞核中获得DNA。RNA有3种，主要存在于细胞质中tRNA---转运RNA----蛋白质合成时搬运氨基酸的工具rRNA---核蛋白体RNA---构成蛋白质的合成场所mRNA—信使RNA---蛋白质合成的模板2种核酸的功能可以这样理解：1.DNA编码了遗传信息。即DNA分子中蕴藏着该物种全部遗传特征。2.RNA使DNA上编码的遗传信息兑现。四、核酸的基本化学组成核酸核苷酸核苷磷酸碱基戊糖核酸的元素组成：CHONP核酸的基本结构单位是核苷酸：即：核酸=核苷酸-核苷酸-……核苷酸=（核苷酸）n请比较：蛋白质的基本结构单位是氨基酸蛋白质=氨基酸-氨基酸-……氨基酸=（氨基酸）n核苷酸=磷酸+戊糖+碱基组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为β-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为β-D-核糖。1.戊糖（五碳糖---甲乙丙丁戊己庚辛）OHHOHHOHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHHOHHD-核糖D-2-脱氧核糖RiboseDeoxyribose己糖：如C6H12O6-------葡萄糖2.碱基⑴.嘌呤（Purine）--------两个环123456978NNNHNNH2腺嘌呤AdenineANHNNHNONH2鸟嘌呤guanineG⑵.嘧啶（Pyrimidine）------一个环123456尿嘧啶uracilNHNHOOUNNHNH2O胞嘧啶cytosineCNHNHOO胸腺嘧啶thymineT3.磷酸H3PO4快速作答1.核酸的基本结构单位是？2.核酸有多少种？3.DNA大多存在于细胞的什么地方？4.RNA多数存在于细胞的哪里？5.核苷酸可以完全水解成哪3个部分？6.常见的碱基有多少种？7.AUCGT各代表什么？8.组成DNA的戊糖和组成RNA的戊糖一样吗？9.下图是嘌呤还是嘧啶？123456978五、戊糖和碱基怎样连接成为核苷？•核苷戊糖+碱基•糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鸟嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNOHHONNNH2HONNOHH2NNNNNNNNH2OHHOHHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHOHHOHHOHHOHHHOCH2OHHOHHOHHHOCH2假尿苷（ψ）次黄苷（肌苷）I黄嘌呤核苷X二氢尿嘧啶核苷D取代核苷的表示方式7-甲基鸟苷m5G5OHAdenosineGuanosineCytidineUridine六、核苷和磷酸怎样连接成核苷酸？核苷酸核苷+磷酸戊糖+碱基+磷酸HHHHHHHHH核苷酸继续磷酸化O-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷(ATP)AMPADPATP刚才那两个图是DNA还是RNA?环化磷酸化cAMPcGMP肌苷酸及鸟苷酸(强力味精)IMPGMP七、核苷酸与核苷酸怎样连接成核酸？上一个核苷酸的C3’-OH与下一个核苷酸的5’-磷酸基形成3’,5’-磷酸二酯键5’5’3’3’上一个核苷酸的C3’-OH与下一个核苷酸的5’-磷酸基形成3’,5’-磷酸二酯键5’5’3’3’5′-磷酸端（常用5’-P表示）；3′-羟基端（常用3’-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是5′→3′或是3′→5′。多聚核苷酸的表示方式DNARNA5′PdAPdCPdGPdTOH3′5′PAPCPGPUOH′或5′ACGTGCGT3′5′ACGUAUGU3′ACGTGCGTACGUAUGUT5’3’OHU5’3’OHOHOHOHOH第三节DNA的结构一、DNA的一级结构脱氧核糖核酸的排列顺序–可以用碱基排列顺序表示连接键：3’，5’-磷酸二酯键–磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架–碱基形成侧链多核苷酸链均有5’-末端和3’-末端DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。2.基因与基因组基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物细胞中DNA分子的最小功能单位（交换单位）。蛋白质（mRNA蛋白质）产物tRNARNArRNA调节功能：调节基因无产物作用未知结构基因基因组（genome）：某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物质的总和。包括：核基因组（拟核/核DNA）及核外（质粒/质体DNA）bp（碱基对）103104105106107108109101010111012人两栖类鱼类藻类酵母细菌E.Coli病毒质粒各种细胞、病毒和细菌质粒中基因组的大小3.原核生物基因组特点重复序列少，多位编码区多为操纵子形式组织有重叠基因存在4.真核生物基因组特点以染色体存在重复序列多基因组计划人类基因组计划（HumanGenomeProject，HGP）酵母基因组计划（YGP）大肠杆菌（E.Coli）二、DNA的二级结构DNA的双螺旋模型1953年，J.Watson和F.Crick在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。DNA双螺旋模型要点B型结构两条链反向平行，右手螺旋碱基在内（A＝T，G≡C）碱基平面垂直于螺旋轴磷酸、戊糖在外构成骨架，双螺旋每转一周为10碱基对（bp）A型结构（了解）碱基平面倾斜20º，螺旋变粗变短，螺距2～3nm。Z型结构（了解）左手螺旋，只有小沟2.0nm小沟大沟双螺旋DNA的结构参数类型旋转方向螺旋直径（nm）螺距（nm）每转碱基对数目碱基对间垂直距离（nm）碱基对与水平面倾角A－DNAB－DNAZ－DNA右右左2.02.31.82.83.44.51110120.2550.340.2720º0º7º双螺旋稳定的力氢键碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力）离子键等则DNA变性剂（热、pH、脲/酰胺、有机溶剂）DNA的存在形式二、DNA的三级结构DNA双螺旋的进一步扭曲构成三级结构，负超螺旋原核双链环状DNA（dcDNA）病毒单链环状DNA（scDNA）单链线性DNA（ssDNA）真核双链线性DNA（dsDNA）第四节RNA的结构与功能一、RNA的结构特点1.碱基:A、G、C、U（A＝U/G≡C）2.多为单链，分子较小3.分三类：⑴mRNA–信使RNA，蛋白质翻译的模板⑵tRNA---蛋白质翻译时转运氨基酸的工具（15%）⑶rRNA---构成蛋白质合成的场所（80%）4.少数病毒是RNA病毒（基因由RNA编码）二、RNA的功能：总体上，DNA编码遗传信息；RNA将其兑现。tRNA的三级结构—三叶草形，重要功能区：⒈反密码环⒉氨基酸臂第五节核酸的性质一、一般的理化性质两性解离/一般呈酸性（在中性溶液中带负电荷），微溶于水，不溶于有机溶剂线性大分子（粘度高。抗剪切力差）可用电泳或离子交换（色谱）进行分离室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解加热条件下，D－核糖＋浓盐酸＋苔黑酚绿色D－2－脱氧核糖＋酸＋二苯胺蓝紫色二、核酸的紫外吸收特性在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。以A260/A280进行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光三、核酸的变性、复性与分子杂交1.变性稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。变性表征生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）变性因素pH（11.3或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）低离子强度加热DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.442.热变性和Tm3.核酸的复性变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。退火温度＝Tm－25℃复性影响因素片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度4.分子杂交DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。Southern杂交（Southernbolting）Northern杂交（Northernbolting）Western杂交（Westernbolting）四、核酸的序列测定1.双脱氧链终止法（Sanger酶法）2.Gilbert化学降解法本章小结核酸是遗传物质载体的证明和研究历史核酸的化学结构：戊糖、碱基（A、T、G、C、U），核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号）DNA的结构：一级结构（核酸序列及其表示、基因及基因组、序列测定）、二级结构（Watson－Crick双螺旋模型、Z－DNA）、结构维持的化学键RNA结构与功能：碱基组成特点、RNA的种类结构及功能核酸的性质：酸碱性、变性与复性、分子杂交