PUMA在大鼠胰腺移植缺血再灌注损伤中的作用

PUMA在大鼠胰腺移植缺血-再灌注损伤中的意义崔海宁张克君王正文【摘要】目的探讨PUMA在移植胰腺缺血再灌注损伤中的早期促凋亡作用。方法对封闭群大鼠建立大鼠腔静脉内分泌引流、肠道外分泌引流的动物模型.再灌注后第0、1、2、3、4、6、9、12h等时点,每时点处死5只大鼠,切取移植胰腺,石蜡包埋切片,原位DNA缺口末端标记(TUNEL)法测定胰腺组织细胞凋亡,Westernblot方法测定移植胰腺组织PUMA,bcl-2、bax、caspase-3蛋白表达.结果再灌注术后第0、1、2、3、4、6、9、12h,胰腺细胞凋亡数分别为(29.42±4.93)、(47.65±6.43)、(74.8±9.73)、(106.35±16.8)、(148.71±19.50)、(123.96±15.54)、(97.32±10.6)和(57.42±9.56)个/高倍视野。各时点均显著高于正常胰腺23.48±4.26。第4小时细胞凋亡数明显增高,12小时降低到最低值,不同组细胞凋亡数的差异有统计学意义(v=42t=2.785P0.01);PUMA以及其下游的bax和caspase-8蛋白表达在第4小时达到最高峰,12小时降低到最低值,bcl-2在第4小时达到最低值,蛋白表达差异分别有统计学意义(P0.05),以后逐渐升高,12小时降低到最低值,PUMA表达与各时点的细胞凋亡数有明显的正相关(n=5,r=1.00,p0.05)结论I/RI后细胞早期凋亡与PUMA活化有关,PUMA是通过调节下游bax、caspase-8、bcl-2基因发挥凋亡促进作用【关键词】胰腺移植;缺血再灌注损伤;凋亡;PUMA蛋白;TheeffectofPUMAexpressioninRatpancreaticallograftsduringischemia-reperfusioninjuryZHANGKe-jun,LIDe-chunZhuXing-Guo,etal.TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Generalsurgery,SuhouChina215006.【Abstract】ObjectiveTostudythepro-apoptosiseffectofPUMAproteininpancreaticallograftsduringischemia-reperfusioninjury.MethodsSDandWistarratswereusedasdonorsandrecipients.Toestablisharatmodelofpancreasticoduodenaltransplantationwithvenacavadrainageandentericdrainage.At0,1,2,3,4,6,9,12haftertransplantation,5animalsweresacrificedateachtimepointineachgroup.ThepancreaticgraftswereremovedforapoptosicanalysisbyusingTUNELassay,andtheproteinofPUMA,bcl-2、bax、caspase-3wasanalizedbyusingwesternblot.ResultsThenumberofapoptosiccellsinpancreaticgraftswas(29.42±4.93)、(47.65±6.43)、(74.8±9.73)、(106.35±16.8)、(148.71±19.50)、(123.96±15.54)、(97.32±10.6)and(57.42±9.56)/400×fieldrespectively;Thenumberofapoptosiccellsin4hweresignificantlyincreasedascomparedwiththeothergroupsateachtimepoint,and.significantlydecreasedin12h.(v=42t=2.785P0.01).TheexpressionofPUMAanditsdownstreamingbaxandcaspase-3weresignificantlyincreasedat4h,anddecreasedat12hafterreperfusion,andbcl-2wassignificantlydeincreasedat4h,andincreasedat12hafterreperfusion(P0.05).TheapoptosiccellsateachtimepointwashighlycorrelatedtoPumaexpression(n=5,r=1.00,p0.05).ConclusionCellapoptosisishighlycorrelatedtoPUMAproteinafterischemia-reperfusioninjury,theproapoptosiseffectofPUMAisgeneratedbyregulatingbax,caspase-8andbcl-2.作者单位:张克君,李德春,朱兴国,朱东明苏州大学第一附属医院普外科215006【Keywords】Rat;Pancreastransplantation;Ischemia-reperfusioninjury,Apoptosis;PUMA近年来大量研究表明,细胞凋亡是器官移植缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusioninjury,I/RI）的早期事件[1]，但细胞发生凋亡的机理不明。PUMA(p53up-regulatedmodulatorofapoptosis)是2001年发现的p53下游促凋亡基因，是bcl-2家族BH-3亚家族中的成员，PUMA在受到p53、缺氧、放射、化疗、等刺激信号下迅速被激活，从而导致PUMA下游bcl-2家族基因的活性改变，引起细胞色素C的释放和Caspase酶的活化，最终导致细胞凋亡[2-3]。本研究应用大鼠胰十二指肠移植模型,探讨PUMA在大鼠胰十二指肠移植I/RI中的早期凋亡促进作用。材料与方法1实验动物：43只（对照组3只）清洁级封闭群SD大鼠(供体),体质量250～300g,雄性；清洁级封闭群Wistar大鼠,40只，体质量300-350g,雄性,均由上海实验动物中心提供。2主要试剂：鼠抗人PUMA多克隆抗体购自CellSignals公司，兔抗鼠bcl-2、bax、caspase-3、Actin多克隆抗体和Westernbloting试剂购自SantaCru公司,细胞凋亡检测试剂盒购南京建成生物工程研究所。3.大鼠胰腺移植动物模型的制备：见文献[4]。4．移植模型的分组和处理：移植模型共分为8组，每组5只；各组大鼠于胰腺再灌注后取移植胰腺。第1-8组分别于移植后0h、1h、2h、3h、4h、6h、9h、12h进行，取出胰腺立即放入-800C冰箱中保存备用，其中以正常SD大鼠3只做对照。5．TUNEL法显示胰腺细胞凋亡：实验方法、结果判断、数据处理参见文献[5]6．Western-blotting检测蛋白表达：参照《分子克隆实验指南》提取冰冻移植胰腺细胞总蛋白，测定浓度后各取100ug蛋白,以actin为内参照，Western-blotting检测PUMA、bcl-2、bax、caspase-8蛋白表达。实验步骤按照说明书进行。采用北京赛智创业科技有限公司ChampGelTM3-4进行Westernblotting图像定量分析,计算各蛋白与内参actin的比值。7统计学：数据均以均数±标准差x±s表示,用SPSS10.0进行统计学处理。结果1手术时间:供体手术时间47±2min,袖套准备2±1min,袖套吻合2.5±1min,热缺血时间2±3min,受体手术时间46±3min,其中动脉吻合10±2min,冷缺血时间52±5min,与文献[4]的结果一致.2．移植胰腺细胞凋亡的检测:再灌注术后第0、1、2、3、4、6、9、12h,胰腺细胞凋亡数分别为(29.42±4.93)、(47.65±6.43)、(74.8±9.73)、(106.35±16.8)、(148.71±19.50)、(123.96±15.54)、(97.32±10.6)和(57.42±9.56)个/高倍视野,正常胰腺细胞凋亡数为23.48±4.26个/高倍视野,不同组细胞凋亡数的差异有统计学意义(v=42t=2.785P0.01)3.凋亡相关基因的分析：PUMA、bax、caspase-8表达自1小时开始表达上调,4小时表达最多,以后表达逐渐减少,12小时表达到最低;而bcl-2表达自1小时开始表达下调,4小时表达最少,以后表达逐渐增多,12小时达到最高,各自的表达差异分别有显著性(P0.05),见图1.4PUMA表达与细胞凋亡的相关性分析:PUMA表达与各时点的细胞凋亡数有明显的正相关(n=5,r=1.00,p0.05)图1:westernblot检测不同蛋白在移植胰腺在I/RI后不同时间的表达讨论实验结果显示:细胞凋亡数自移植灌注后1小时开始明显升高,4小时达到最高,以后逐渐下降,12小时达到最低,,这与[1,6]的研究结果基本相同,说明细胞凋亡是胰腺移植I/RI后的早期事件。Westernblot发现,PUMA在I/RI后4小时表达最明显,以后逐渐下降,12小时后降到最低水平,并且PUMA蛋白表达与细胞凋亡具有明显的正相关,说明I/RI后早期细胞凋亡与PUMA高度活化有关.与此同时,PUMA下游bax、caspase-8促凋亡蛋白也遵循PUMA的表达变化,而PUMA下游的bcl-2抑凋亡蛋白与PUMA的表达规律相反,说明PUMA是通过调节下游的bax、caspase-8、bcl-2基因发挥凋亡促进作用的.我们的实验提示,抑制PUMA基因活化可能有助于预防I/RI后早期细胞凋亡.该研究为以后的I/RI的防治提供理论依据.参考文献:[1]ZhaohuiZ,XiL,KuiyangL.ApoptosisinducedbycoldischemiaandReperfusionafterpancreastransplantationinrats.JDigestiveSurg,2004,3:278-281.[2]Yu,L.Zhang,P.M.Hwang,K.W.etal.PUMAinducestherapidapoptosisofcolorectalcancercells[J].Mol.Cell;2001,12(7):673–682.[3]Nakano,K.H.Vousden.PUMA,anovelproapoptoticgene,isinducedbyp53[J].Mol.Cell,2001,12(7):683–694.[4]朱兴国，陈彦，李德春，等。大鼠胰十二指肠移植动物模型的制作；中华实验外科杂志2005，22（4）：496-497[5]李占京韩本立吴军。胰腺移植急性排斥反应中的细胞凋亡；中华实验外科杂志，2000；17（4）：335-336[6]DrognitzO,vonDobschuetzE,KisslerbH,etal.Organprocurementinexperimentalpancreastransplantationwithminimalmicrocirculatoryimpairment.EurSurgRes,2004,36:185219武汉市丁字桥路100号430064