RAPD技术在玉兰亚属植物分类研究中的应用_

RAPD技术在玉兰亚属植物分类研究中的应用*王亚玲1,2，张寿洲3，崔铁成2（1西北农林科技大学，陕西杨陵712100；2西安植物园，西安710061；3仙湖植物园，深圳518004）摘要：对玉兰亚属的17个种进行RAPD标记实验的结果表明：RAPD标记在玉兰亚属内具有很高的多态性，证明RAPD标记可作为木兰科低等级分类单元的分类依据。聚类分析结果显示，分布于美洲的渐叶木兰与其它分布于亚洲的种类明显分开，滇藏木兰与亚洲的其余15个种也具有较远的亲缘关系，其余各个种各自聚类，种间均有着不同的遗传距离。RAPD及分子序列测定分析结果均不支持玉兰亚属以萼片状花被片、开花时间、花被片颜色作为分组的依据，建议玉兰亚属以地理分布特征作为分组依据，建立亚洲组与美洲组两个类群。关键词：玉兰亚属；RAPD标记；分类StudiesonClassificationofSubgenusYulaniabyRAPDAnalysisWangYaling1,2,ZhangShouzhou3,CuiTiecheng2(1NorthwestSci-TechUniversityofAgricultureandForestry,Yangling,Shanxi712100;2Xi’anBotanicalGarden,Xi’an710061;3ShenzhenFairyLakeBotanicalGarden,Shenzhen518004)AbstractSeventeenspeciesweretestedbyRAPDanalysis.TheresultsindicatedthatRAPDpatternswithinSubgenusYulaniawerehighlypolymorphic,whichcouldbeusedfortheclassificationofMagnoliaceaeatthelevelofspecies.M.acuminataoriginatingfromNorthAmericacouldbeobviouslydistinguishedfromtheotherspeciesfromAsiabytheclusteranalysis.OftheAsiaspecies,therelationshipsbetweenM.campbelliiandtheotherAsiaspecieswerepoor.TherestAsiaspecieswereclusteredintodifferentgroupsrespectivelyandthereweredifferentdistancebetweenanytwospecies.TheresultsfromRAPDandsequenceanalysisdidnotsupportsectionaltreatmentsoftheSubgenusYulaniabasedonsepaloidtepals,timeofflowering,andthetepalcolor.ItwassuggestedthatSubgenusYulaniacouldbedividedintotwosections:sectionAsiaandsectionAmerica.Keywords：SubgenusYulania；RAPDanalysis；classification木兰属玉兰亚属(MagnoliasubgenusYulania))植物为落叶乔木或灌木，栽培历史悠久，有许多著名的园林观赏和药用种类。由于该亚属分布范围广，自然杂交容易，形态变异类型多，为该属的分类造成一定的困难。随着分子生物学的发展，RFLP、RAPD、cpDNA基因序列测定等分子生物学手段在植物系统学研究中越来越受到重视。RFLP及matK、trnK间隔区、psbA-trnH、atpB-rbcL、ndhF、trnL、trnL-trnF等cpDNA序列的测定分析也已在木兰科（Magnoliaceae）植物分子系统学研究中得到应用，在验证了许多解剖学、形态学观点的同时，也提出许多与形态学分类很不相同的系统发育树，对一些传统的分类依据提出了质疑[1-4]。但由于木兰科植物具有原始保守性，cpDNA序列在本科中进化很慢，碱基变异位点相对其它被子植物变化要少的多，所能提供的信息量较少，使cpDNA序列分析在木兰科系统研究中的应用受到限制。RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）是一种运用随机引物扩增整个基因组，来寻找多态性DNA片段作为分子标记的技术，是一种多态性极高的分子标记手段，被广泛应用于遗传多样性、分子辅助育种、种间或属间遗传关系、品种的分类鉴定、基因定位与分离、构建遗传图谱等方面的研究。RAPD技术在木兰科植物的研究上应用不多，遗传多样性*基金项目：深圳市仙湖植物园科研基金资助。作者简介：王亚玲（1971—），女（汉族），助研，西北农林科技大学在职硕士研究生。2方面的研究仅见于观光木属（Tsoongiodendron）、鹅掌楸属（Liriodendron）[5-6]。系统发育研究方面仅应用于含笑亚族（Trib.Michelieae）的系统分析，并得出了与cpDNA序列测定分析基本一致的结果[7]。本研究目的在于借助RAPD技术来检测玉兰亚属种间的亲缘关系，对经典的形态学分类及现代cpDNA序列分析结果进行验证。1材料与方法1.1材料包括玉兰亚属15个种和新发表的2个种，种名及来源见表1。表1本研究所用的材料及其来源Table1Thesamplesandtheirsourcesinthisstudy编号中文名拉丁名来源编号中文名拉丁名来源1白玉兰M.denudata华南植物园10日本辛夷M.kobus华南植物园2天目木兰M.amoena华南植物园11星花玉兰M.stellata仙湖植物园3滇藏木兰M.campbellii华南植物园12柳叶木兰M.salicifolia昆明植物园4凹叶木兰M.sargentiana华南植物园13渐叶木兰M.acuminata华南植物园5武当木兰M.sprengeri华南植物园14辛夷M.liliiflora华南植物园6湖北白玉兰M.elongata华南植物园15景宁木兰M.sinostellata仙湖植物园7宝华玉兰M.zenii华南植物园16伏牛山木兰M.funiushanensis仙湖植物园8望春玉兰M.biondii仙湖植物园17二乔玉兰M.soulangeana仙湖植物园9黄山木兰M.cylindrica华南植物园181.2DNA提取选用新鲜幼嫩的叶片或硅胶快速干燥保存的叶片作为材料，采用改进的CTAB法提取DNA[8]。每个种采2个个体，分别提取DNA后，等量混匀，用λDNA估算DNA的浓度，并将模板稀释至20-40ng用于RAPD-PCR反应。1.3引物的筛选从SBS赛百威的A字号和上海生工的S字号共55个引物中筛选出多态性好、条带亮、清晰无弥散的引物15条（表2），对所有的样品进行PCR扩增。1.4DNA扩增条件扩增反应在eppendorf梯度PCR扩增仪上进行，反应体系为25μl，包括DNA20-40ng，引物10pmol，dNTP0.1mmol/L，10xBuffer2.5μl,TaqDNA聚合酶1U。扩增程序为：94℃，3’50”—→94℃,35”—→36℃，1’—→72℃，2’—→45个循环—→72℃，7’。扩增产物加入6x溴酚蓝3μl，在含表2本研究所用的引物序列0.5%EB（溴乙锭）的1.5%的琼脂糖凝胶中，用Table2Thesequenceprimersofwhichused1xTAB缓冲液、以3.7v/cm的电压电泳2小时30分钟后，将凝胶置于SYNGENE凝胶成像系统中照相。1.5谱带的统计分析电泳图谱中的每一条带（DNA片段）作为一个分子标记。根据各分子标记的迁移率及其有无计算所有位点的二元数据：显带记为“1”，无带记为“0”。记带的原则为：①只记录易于辨认的条带，排除模糊不清的带；②在所要比较的泳道中无法准确标识的带予以排除；③对于迁移率相同，但强度不同的带，当强带的强度超过弱带的2倍时，弱带记为“0”；④与对照反应产物具有相同的迁移率的带不记。人工记数后，计算多态位点百分率P，P=多态位点/位点总数。数据用MEGA2.1软件，以p-distance方法计算距离系数（表3），得到UPGMA（unweightedpairgroupmethodusingarithmeticaverage）聚类图（图2）。编号No.序列SequencesA1CAGGCCCTTCS4GGACTGGAGTS5TGCGCCCTTCS21CAGGCCCTTCS41ACCGCGAAGGS43GTCGCCGTCAS61TTCGAGCCAGS65GATGACCGCCS101GGTCGGAGAAS104GGAAGTCGCCS105AGTCGTCCCCS121ACGGATCCTGS123CCTGATCACCS125CCGAATTCCC3图1引物S4对17个供试材料的扩增图谱（材料编号种名见表1）Fig.1ThePCR-mapof17species（TheNo.andnameofspeciesseeTable1）2结果用筛选的15条引物对所有样品进行PCR扩增，共扩增出274条带，扩增带最多的引物是S121（25条带），最少的是S23（10条带），平均每个引物产生18.3条带，片段长度多集中在300-1200bp（图1）。渐叶木兰、滇藏木兰、柳叶木兰等9个种具特异性带37个，占总带数的13.5%，其中这三个种的特异性带数最多，分别为11、8、9个。单态位点仅12个，多态性位点百分率高达95.6%，产生的多态性带数与所用引物数的比例为17.6。根据邹喻苹等（2001）的统计数据，在已进行过的种间系统关系研究中，平均所用引物数为14.2，多态位点百分率为87.7%，多态性带与所用引物数的比例为13.4，比较而言，玉兰亚属的RAPD结果显示了较高的多态性[9]。通过计算距离系数建立的距离距阵中，距离最近的两个种为白玉兰和宝华玉兰，为0.092，最远的为滇藏木兰与伏牛山玉兰，为0.892。表3玉兰亚属各种的距离系数距阵Table3Thematrixofdistancecoefficientbetweenspeciesbasedon274RAPDbandsOTU123456789101112131415161710.00020.4300.00030.4380.6970.00040.2510.5680.4210.00050.1830.5680.4210.1520.00060.2630.5460.4050.2270.1730.00070.0920.4750.4130.2450.2100.2100.00080.3430.1680.7430.4750.4380.4380.3960.00090.1570.3730.4130.2210.2450.2570.1620.3220.000100.4300.1940.7590.6410.5910.5910.4560.2330.4750.000110.2630.5460.4560.2510.2160.3580.3220.3880.2950.4650.000120.4050.5240.5570.4560.4560.4560.4300.4750.3960.4650.4560.000130.5680.6820.6680.5240.5040.5680.7120.7270.4940.8510.4650.7940.000140.2570.2630.5460.3080.3220.2950.2630.3080.2630.3730.3810.3220.6280.000150.3810.4050.6680.4300.3360.3650.4050.3080.4050.3730.3500.5910.6820.3580.000160.3580.3650.8920.4050.3880.3880.3810.205