RNAi在类风湿性关节炎中的研究进展

RNAi技术在类风湿性关节炎中的研究进展丁庆军，刘明综述梁统，周克元审阅（广东医学院生物化学与分子生物学研究所，广东湛江524023）[关键词]类风湿性关节炎(RA);RNA干扰（RNAi）;自身免疫[中图分类号]R39211[文献标识码]A类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种慢性、致残性的自身免疫性疾病。临床表现为侵害对称性关节和关节周围组织肿痛，以关节滑膜病变为主的滑膜炎持久反复发作,导致关节内软骨和骨的破坏。尽管类风湿性关节炎的病因及发病机制至今尚不完全清楚，但大量研究表明，某些基因异常表达是RA发病的内在原因。因此，从基因水平上探讨治疗RA的途径将具有广阔的前景。RNAi技术作为一种新兴的基因治疗手段，与传统的基因治疗方式如反义寡核苷酸治疗等相比，RNAi具有高度的序列特异性，从而实现对目的基因的精确沉默；而且干扰效率高。RNAi还具有高稳定性、细胞摄取相对容易、毒性小等优点，为RA治疗带来新的希望。1RNA干扰的作用机制RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指外源或内源的双链RNA(dsRNA)特异性地引起基因表达沉默的现象，是一种序列特异性的转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilence,PTGS)。目前,对于RNAi的发生机制普遍认为是:外源性(如病毒)或内源性的dsRNA在细胞内被Dicer切割成21～23nt的RNA片段，这些小片段即为小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)。siRNA带有3′末端羟基，并且有2个突出的单链核苷酸尾巴及磷酸化的5′端，是RNAi的起始诱导物。Dicer是一种进化上保守的RNA酶Ⅲ蛋白酶，具有dsRNA特异性的内切核酸酶，还可以与siRNA结合形成沉默复合体(RNAinducedsilencingcomp1ex,RISC)。其中一条siRNA作为引导序列，按照碱基互补原则识别互补的收稿日期：2007-06-21；接受日期：2007-基金项目：广东省社会发展领域科技计划资助项目（53025）。作者简介：丁庆军（1975-）男，山东曲阜人，硕士生Tel:13763049275；E-mail:[e-mail]，并引导RISC结合mRNA。在消耗ATP的情况下将mRNA切割，有效地导致转录后基因的沉默[1]。RNAi技术在癌症、抗病毒、基因组等研究领域得以广泛的应用，目前，该技术在RA领域的研究和应用虽不广泛，但也逐渐开始有文献报道。2抑制TNF-α基因表达TNF-α是机体炎症反应与免疫应答的重要调节因子，效应与靶细胞的范围与IL-1β有很大相似性，能刺激滑膜细胞和软骨细胞合成PGE2和胶原酶，促进成纤维细胞增生，导致关节局部滑膜炎症和软骨组织破坏，TNF-α既能刺激IL-1，IL-6，IL-8的产生，又能刺激巨噬细胞增加自身的合成，在RA的细胞因子网络中起“中心犯罪”作用。传统治疗的研究表明，阻断TNF-α是有效的治疗策略，可以改善RA的病情。如表达人TNF-α的转基因小鼠可形成关节炎，用抗TNF-α抗体治疗可使关节炎症状减轻。加利福尼亚大学的DanielEFurst博士及其同事在2005-12的JRheumatol上报告了一种叫Pegsunercept的新药，对类风湿性关节炎(RA)有较好疗效，它实际上是一种肿瘤坏死因子(TNF)的抑制剂。研究显示，较高剂量组显示较大的临床改善，治疗组和安慰剂组的总体不良反应发生率相似[2]。因此，以TNF-α的mRNA为靶点，采用RNAi技术特异性抑制TNF-αmRNA的表达，减少TNF-α的分泌，对降低RA损伤，保护关节细胞功能具有重要意义。TaishiP等[3]在对大鼠的研究中发现，针对TNF-α的siRNA在体外实验可以使TNF-αmRNA下降45%，但不影响IL-6的水平；在体内与对照组相比可使TNF-αmRNA显著下降，同时也使IL-6的mRNA水平降低，TNF-α反应的免疫细胞也是减少的。SchiffelersRM等[4]以TNF-α为设计靶点，用局部注射法和电穿孔法将设计好的siRNA导入CIA（胶原诱导的小鼠关节炎模型）小鼠关节内，使其沉默TNF-α。结果，电穿孔法组强烈的抑制TNF-α进而抑制了关节的炎症，而局部注射法则没有治疗效果。传统治疗的研究表明，TNF-α阻断药非常有效，但会出现某些不良反应，如感染、癌症、血管炎、狼疮样自身免疫性疾病、多发性硬化症样脱髓鞘疾病、肝脏疾病、血液学异常(再生障碍性贫血)、淋巴瘤、严重的变态反应等，不过这些不良反应所占的比例比较低[5]。RNAi技术特异性抑制TNF-αmRNA的表达是否会引起上述不良反应还需要进一步的研究。3抑制NF-[kappa]B基因表达NF-κB是1986年Sen等[6]首先从B淋巴细胞核抽提物中检测到的，可与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列(GGGACTTTCC)特异结合的核蛋白因子。NF-κB普遍存在于真核细胞中，是一关键的转录因子家族，能与多种基因的启动子或增强子上的特异性位点结合并促进基因转录的一类蛋白质的总称，其由NF-κB家族及其抑制物IκB家族共同组成。RA炎症反应中IL-1β与TNF-α在NF-κB正反馈放大活化机制中所起的“中心罪犯”作用已被大量的研究所证实。Wang等[7]在RA的FLSs（纤维样滑膜细胞）中，用siRNA的方法敲除了JAB1的作用，导致NF-kappaB活性下调和凋亡应答恢复，使IkappaB-alpha的降解延缓。同时还抑制了JNK的磷酸化。Palao等[8]用shRNA表达质粒直接对培养的RAFLS中的FLIP(Flice-likeInhibitoryProtein)基因进行RNA干扰。结果抑制了FLIP表达，进而导致FAS诱导的NF-[kappa]B的活性下降。周晓彤等[9]利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κBp65的siRNA转染小鼠EOMA细胞．RT-PCR测定细胞内NF-κBp65mRNA表达，Westernblot检测细胞内NF-κBp65蛋白水平。结果显示：在转染siRNA后的第24h，细胞内NF-κBp65mRNA水平降低。蛋白表达量明显减少。而在第48h、72h细胞内NF-κBp65蛋白已经无法测出；说明RNAi技术可以抑制NF-κBp65的表达。Lee等[10]以NF-kappaB的亚单位p65(RelA)为靶点，设计siRNA。通过其作用于从类风湿性关节炎患者的关节腔中分离出的纤维样滑膜细胞后，其致炎细胞因子、化学因子和抗凋亡基因均受到明显的抑制。此外，与分别抑制P65和P50相比较，同时抑制P65和P50对细胞凋亡作用更具有广泛性的效果。由于NF-κB是TNF-α和IL-1的上游调节因子，所以当用siRNA抑制NF-κB路径以后，同时还可以很好的抑制TNF-α和IL-1的表达[11]。4抑制其他基因的表达因为RA是多基因病变引起的疾病，所以除了上述基因外还有其他基因的研究。抗凋亡相关基因在RA患者滑膜细胞的表达增强，从而使细胞凋亡减少，存活时间延长，导致关节滑膜增生。对抗程序性细胞死亡是RA获得持久性炎症的重要原因之一。Mcl-1（myeloidcellleukemia-1)是Bcl-2家族的成员之一，Mcl-1与BAX相互作用而抑制细胞凋亡，对RA患者关节中的巨噬细胞的存活起着至关重要的作用。LiuHongtao等[12]研究发现，RA患者滑液中的巨噬细胞中Mcl-1的表达与正常组相比明显高。用siRNA抑制Mcl-1基因的表达，可使使滑液巨噬细胞凋亡。因此，Mcl-1基因可以作为治疗RA的一个靶点。人类白细胞抗原(HLA)-DR分子、抗原肽及T细胞受体(TCR)三者之间的相互识别以及三分子复合物的形成是类风湿关节炎(RA)发病的始动环节。RA易感的HLA-DR4亚型HLA-DRB1等位基因，主要包括：HLA-DRB1*0401、0404、0405等。利用小分子干扰RNA双链体(siRNA)也可以有效地特异性地导致这些基因的转录后的沉默。张翠华，陈巧林等[13]，针对HLA-DRB1*0405基因序列设计并构建6个小发夹RNA(shorthairpinRNA，shRNA)表达质粒和1个针对无关序列的shRNA表达质粒。脂质体瞬时共转染两种质粒至人胚胎肾细胞293。结果所设计的6个HLA-DRB1*0405siRNA可不同程度的抑制HLA-DRB1*0405在293细胞中的表达，对mRNA水平，其抑制率最高可达89.25％，在蛋白水平，其抑制率达46.70％。为利用RNA干扰抑制RA中HLA-DRB1介导的异常免疫反应提供了试验依据。5展望及问题目前，RNAi技术在RA研究中的应用仍然较少，因此，仍存在很多问题尚待解决：（1）在哺乳动物体内的研究资料较少，对其副作用的了解仍不全面，尚不能准确评价其在动物水平的安全性。（２）siRNA导入动物细胞仍有困难。目前主要有2种方式导入：一是脂质体包装法，二是病毒载体法。脂质体法简单，可操作性强。Sorensen等[14]用阳离子脂质体siRNA成功地抑制了小鼠体内TNF-α基因的表达；Santel等[15]，用阳离子脂质体包装的siRNA，采用静脉注射法转入小鼠体内，得到了较高的转染率。体内的靶基因CD31和Tie2的mRNA和蛋白质都有明显下调。但脂质体包装法往往转染效率低，且siRNA在细胞内的作用时间短，总体干扰强度低，另外大部分脂质体对细胞有一定的毒性，不适合临床治疗。病毒载体法尤其是构建的表达型载体，可以克服脂质体的一些缺点。shRNA表达载体，克服了其他方法昂贵、siRNA作用时间短暂等问题，含有shRNA表达载体的菌株可长期保存和大量扩增[13]。同时病毒载体法转染效率高，且siRNA在细胞内的作用时间长，效果好，但存在一定的安全隐患。siRNA要最终进入体内治疗RA，安全高效的病毒型表达载体法可能是最终的选择。(３)局部干扰和系统干扰哪一个更好？局部干扰副作用小，但操作难度大，作用时间短。系统干扰操作简便，干扰作用时间长，但未知因素较多，存在较大的安全隐患。(4)由于RA是多基因引起的疾病，目前仍没找到最有效的干扰靶点，但有研究表明NF-kappaB似乎是最好的靶点之一[16]。参考文献：[1]MatzkeM,MatzkeAJ，KooterJM.RNA:guidinggenesilencing[J].Science,2001,293(5532):1080-1083.[2]DanielE.FurstAPhase2Dose-FindingStudyofPEGylatedRecombinantMethionylHumanSolubleTNFTypeIinPatientswithRA[J]JRheumatol，2005,32(12):2303-2310.[3]TaishiP,ChurchillL,WangM,etal.TNFalphasiRNAreducesbrainTNFandEEGdeltawaveactivityinrats[J].BrainRes,2007,1156（5）:125-132.[4]SchiffelersRM,XuJ,StormG,etal.EffectsoftreatmentwithsmallinterferingRNAonjointinflammationinmicewithcollagen-inducedarthritis[J].Arthritis&Rheumatism,2005,52(4):1314-1318.[5]ColombelJF,LoftusEVJR,TremaineWJ,eta1.ThesafetyprofileofinfliximabinpatientswithCrohn’sdisease:theMayoclinicexperiencein500patients[J].Gastroenterology,2004，12