原核生物的基因表达与操作

3原核生物的基因表达与操作3.1原核生物的基因表达3.2有功能的启动子的分离3.3可调控强启动子驱动的基因表达3.4原核生物表达产物的分离纯化目的基因载体体外重组重组子（杂合DNA）转化受体细胞筛选阳性克隆大量扩增，获得子代DNA基因克隆的技术路线大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系优越性：1.对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解；2.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；3.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。大肠杆菌中表达体系的不足：1.真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。2.真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。3.真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。4.许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在；5.细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。大肠杆菌表达载体启动子核糖体结合位点转录终止子3.2有功能的启动子的分离一般程序：1.选用一种适当的核酸内切酶，消化切割大肠杆菌的染色体DNA2.接着将切割产生的DNA限制片断群体，同一种无启动子的质粒载体重组，按实验设计要求使插入的片断恰好紧邻报告基因的上游位置3.随后把此重组混合物转化给大肠杆菌寄主细胞，构成质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。报告基因（reportergene）：特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也可用来同任何一种目的启动子连接，因此其表达活性可作为检测启动子功能的依据。用大肠杆菌质粒pBR316筛选启动子用pK01筛选启动子分离有功能启动子的两个实例：用大肠杆菌质粒pBR316筛选启动子1.构建质粒pBRH3B和pBRH12.筛选启动子使用四环素（Tetr）作报告基因分离功能启动子用pK01筛选启动子使用galK（半乳糖激酶基因）作报告基因分离功能启动子能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体系统。来源于pBR322检测启动子强弱的原理：半乳糖激酶能够从ATP分子上转移一个磷酸集团给半乳糖分子，从而催化半乳糖发生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。用同位素标记ATP，测定从ATP转移到半乳糖去的32P的放射性强度，可推算报告基因（galK）表达的半乳糖激酶的产量。分离功能的启动子将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在pOK1质粒载体的单克隆位点上；将DNA重组分子，转化给宿主细胞（GalE＋、GalT＋、GalK－），避免内源半乳糖激酶的干扰；将它们涂布在麦氏培养基（含有PH值指示剂的中性红和结晶紫，检测碳水化合物）上，筛选转化子（重组子产生红色的菌落）。3.3可调控强启动子驱动的基因表达3.3.1可调控的启动子3.3.2常用原核表达载体3.3.3提高蛋白的表达量3.3.6非融合蛋白的表达3.3.7融合蛋白的表达及纯化3.3.9增强蛋白质的稳定性3.3.10DNA整合入宿主染色体中3.3.11加强分泌内容：Lac(乳糖启动子)Trp(色氨酸启动子)Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)PL(λ噬菌体的左向启动子)T7噬菌体启动子3.3.1可调控的启动子通过与阻遏蛋白的相互作用来控制基因的启动和停止大肠杆菌的Lac启动子来自大肠杆菌的乳糖操纵子由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的结构基因所组成受活化蛋白和cAMP的正调控，阻遏蛋白的负调控受IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）、TMG（硫甲基半乳糖苷）、ONPG（邻硝基苯基半乳糖苷）的诱导LacUV5启动子：Lac启动子的衍生物大肠杆菌的trp启动子来自大肠杆菌的色氨酸操纵子由启动子、衰减子、操纵基因及trpE的部分结构基因组成受阻遏蛋白和衰减子的调控，阻遏蛋白前体必须与色氨酸结合才有活性3-β-吲哚丙烯酸（IAA）可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，提高转录活性。Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，其启动能力比Lac和trp都强；受Lac阻遏蛋白的负调节，受IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的诱导。PL启动子λ噬菌体的左向启动子PL来自λ噬菌体早期左向转录启动子，活性比Trp启动子高约11倍；受控于温度敏感的阻遏蛋白cI。在低温(28-30℃)时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高温(42℃)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL启动子转录。3.3.2常用原核表达载体含Lac启动子的表达载体，如pOP203-13。含trp启动子的表达载体，如pDR720。含tac启动子的表达载体，如pKK223-3。含PL启动子的表达载体，如pPL-λ。分泌蛋白表达载体融合型表达载体：----融合蛋白非融合型表达载体：---天然完整蛋白分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙3.3.3提高蛋白的表达量1、选择合适载体，提高翻译水平强启动子----提高转录水平核糖体结合位点（ATG---SD）避免产物降解：分泌/融合表达细菌蛋白酶抑制剂2、选择合适宿主Lac启动子----LacI菌PL启动子--------cI857溶源菌3、诱导表达温度诱导------PLIPTG的化学诱导----Plac、Ptac4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解若克隆的基因所用的密码子为宿主罕见密码子，可对外源基因进行定点突变或对宿主细菌进行改造。3.3.6非融合蛋白的表达非融合蛋白：指所表达的外源蛋白的N端或C端不含任何其他氨基酸。所表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合基因非融合型蛋白表达非融合蛋白特点：1、表达时要求高：SD序列与ATG的距离要合适。即使改变2-3个碱基，表达效率也会大受影响。2、优点：能够较好地保持原来蛋白的活性。3、缺点：在宿主细胞内容易被蛋白酶降解，蛋白产量低；分离纯化费时费力，成本较高。非融合蛋白抗宿主蛋白酶降解方法：1、选用Ion-（黄嘌呤核苷）营养缺陷型宿主菌2、利用细菌蛋白酶抑制剂融合蛋白：是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。这样的蛋白质有一段短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白。3.3.7融合蛋白的表达及纯化融合型蛋白表达PSDForeignDNA融合型表达载体融合基因融合蛋白的表达及纯化1、构建融合蛋白表达载体：在外源蛋白的N或C端加标记物（如谷胱甘肽S-转移酶标记物、6×组氨酸标记物、Flag或HA肽段标记物、CBP标记物等）；在标记物和外源蛋白之间插入一段可被蛋白酶识别的氨基酸序列。2、转化原核细胞并诱导表达3、裂解细胞，亲和柱层析分离融合蛋白4、切割融合蛋白获得目的蛋白主要步骤：例：谷胱甘肽S-转移酶标记物融合蛋白质的纯化的基本原理：利用与融合蛋白质配偶体相对应的配体作为吸附剂，制备亲和层析柱，通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋白质被滞留下来，其它蛋白质则流出柱外，经洗脱处理，便可回收到纯化的融合蛋白质。融合蛋白质中目的蛋白的纯化1.溴化氰（CNBr）切割法：能特异性的从甲硫氨酸残基处切割多肽链。如胰岛素的制备。2.胰蛋白酶切割法：能从精氨酸或是赖氨酸残基羧基一侧进行特异性的切割。3.凝血因子Xa切割法：能唯一地从特异识别序列C－末端切割多肽3.3.9增强蛋白质的稳定性3.3.10DNA整合入宿主染色体中3.3.11加强分泌外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位:1.细胞质中表达2.周质中表达3.胞外表达1、细胞质中表达:外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包含体。包含体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。影响其形成的关键因素：电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分优点：1.形成包含体a.蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离b.蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用c.蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受伤害2.蛋白质的产量高二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，会导致外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达。3.表达的质粒载体构建比较简单。缺点：1.包含体a.蛋白质折叠了，再折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性b.蛋白质的终产量偏低c.蛋白质的生产成本比较昂贵2.还原的环境不利于二硫键的形成（硫氧还蛋白系统、谷氧还蛋白系统）3.蛋白质会被酶解4.蛋白质种类多，因此纯化比较复杂2、周质中表达周质：在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细胞质中穿过细胞质内膜进入周质。优点：1.由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标蛋白质的纯化就比较简单2.蛋白质酶解的程度不甚严重3.促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用（氧化环境）在正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在体内对信号肽进行切割缺点：1.信号肽并非总是有助于蛋白质的转运2.有可能形成包含体3、胞外表达使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白质，分泌到胞外培养基中进行分离纯化。途径：1.用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分泌型的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。（不是特别有效的程序）2.诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏，导致胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。（可以分离到中等产量的蛋白质）优点：1.蛋白质的酶解作用程度低2.由于分泌到胞外的蛋白质种类少，因此目标蛋白容易纯化3.增进了蛋白质的折叠作用缺点：1.在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白质，通常是不会分泌到胞外培养基中去的2.由于分泌在胞外培养基中的蛋白质相当稀释，因此目标蛋白质的纯化过程比较复杂3.4原核生物表达产物的分离纯化包含体蛋白的提取蛋白质的复性蛋白质的纯化蛋白质的PEG化蛋白质的质量检测1、包含体蛋白的提取细菌的收获包含体的洗涤破碎离心包含体蛋白的变性（溶解）蛋白质的复性及纯化（0.1%以下的中性去污剂，如Tween20）（变性剂：尿素、盐酸胍提高PH、温度及离子强度）（超声破碎、机械破碎、化学方法破碎）（5000-10000g）2、蛋白质的复性通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M时复性过程已经结束。复性中常采用的方法：稀释复性、透析复性、超滤复性、柱上复性等。3、蛋白质的纯化层析类型离子交换层析亲和层析疏水作用层析反相作用层析凝胶排阻层析经向层析分离技术4、蛋白质的PEG化聚已二醇（polyethyleneglycol，PEG）是一种不带电的线性亲水分子，它可以与蛋白质的非必需基团共价结合，形成空间构象上的屏障，从而避免外源蛋白的抗原决定簇诱导产生抗体；甚至可以阻止抗体与之结合。在蛋白质的PEG化过程中，最关键的问题是确定最佳修饰程度和选用合适相对分子质量的PEG。3.4.5原核表达蛋白的质量控制