PCR实验步骤

qRT-PCR实验步骤应用LightCycler®/LightCycler®480SystemRealTimePCR扩增仪的操作方法一、按下列组分配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）试剂使用量终浓度SYBR®PremixExTaqII（TliRNaseHPlus）（2×）10.0μl1xPCRForwardPrimer（10μM）0.8μl0.4μMPCRReversePrimer（10μM）0.8μl0.4μMcDNA模板（100ng）5.0μlDEPC水3.4μlTotal20.0μl注意：1、通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0μM范围内调整引物浓度。2、在20μl的反应体系中，DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。另外，2StepRT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。二、进行RealTimePCR反应LightCycler®480System：Stage1：预变性95℃30s（升温速率4.4℃/s）1CycleStage2：PCR反应分析模式：定量分析95℃5s（升温速率4.4℃/s）60℃30s(升温速率2.2℃/秒，AcquisitionMode:Single)40CyclesStage3：溶解分析模式：溶解曲线95℃5秒钟(升温速率4.4℃/秒)60℃1分钟(升温速率2.2℃/秒)95℃(升温速率0.11℃/秒,AcquisitionMode:Continuous,Acquisitions:5per℃)1cycleStage4：降温40℃30秒钟(升温速率2.2℃/秒)1cycle三、实验结果分析反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器操作手册。