PCR技术用于基因治疗及研究的进展

分子生物学课程论文题目PCR技术用于基因治疗及研究的进展班别学号姓名成绩PCR技术用于基因治疗及研究的进展摘要PCR技术与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个现代分子生物学的实验工作基础。PCR技术使微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可使核酸研究脱离活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。[1]本文在简述PCR技术原理的基础上,综述了PCR在基因治疗和生物研究方面的概况。关键词PCR技术聚合酶链式反应DNA体外扩增基因治疗1.前言1983年KaryMullis发明了一种特异性DNA体外扩增技术—聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）,是体外扩增DNA序列的技术.原来的PCR只能单纯扩增已知两端序列之间的DNA片段，现在可以扩增到已知序列两侧的未知序列，甚至可以扩增到序列未知的新基因。PCR的模板也从原来要用的DNA发展到直接用RNA作为模板，即反转录PCR，这就使得从真核生物中扩增目的基因变得很容易。PCR原本是一种定性的方法只能回答样品中有无目的基因存在，现在已经可以用来定量测定，即回答样品中原始模板的确切数目。PCR扩增的片段也从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。PCR也从单纯用来扩增基因到能将两个以上的基因连接起来，省去了限制性内切酶消化和用连接酶连接的步骤，这就是所谓的克隆PCR。再加上PCR方法与其他方法联合应用，到目前为止已报道的PCR方法有几十多种之多。PCR技术建立以来，在20多年的时间里发展很快，已有一系列PCR方法被设计出来，并广泛应用于遗传学、微生物学乃至整个生命科学的研究中。PCR技术的出现极大地推动了分子生物学的发展。[2]由于PCR技术的实用性和极强的生命力，PCR方法还将会被不断完善，进一步在生命科学研究中发挥更大的作用。2.PCR技术的发展简史[3]1953年沃森（Watson）与克里克（Crick）提出的DNA结构模型。1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制。1971年Korana最早提出核酸体外扩增的设想：经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermusaquaticus中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶等特点。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶TaqDNAPolymerase。此酶的发现使PCR得以广泛应用。20世纪90年代中期，随着多种自动化PCR扩增仪的问世，PCR技术迅速普及，其应用范围也越来越广泛。近年来，PCR技术从原来的定性检测迅速发展到实时定量检测，它克服了传统PCR的许多不足，在分子诊断及其他相关领域发挥着重要作用。3.PCR技术原理及操作PCR的基本原理是以拟扩增的DNA分子为模版，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完新的DNA合成，不断重复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。因为新合成的DNA也可以作为模板，因而PCR可使DNA的合成量呈指数增长。PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR的基本反应由三个步骤组成：1变性，通过加热模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除；2退火，将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；3延伸，将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成新生DNA链延伸。以上三步为一个循环，新和成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经过多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。[4]（一）变性双链DNA模板的变性温度由其G+C含量来决定，模板DNA的G+C含量越高，熔解温度越高，变性的时间有模板DNA分子长度决定，DNA分子越长，两条链完全分开所需的时间越长。如果变性温度过低或时间太短，模板DNA中往往只有富含A-T的区域被变性，这样在后续的反应中，随着温度的降低，模板DNA将会重新复性变成天然结构。在应用TaqDNA聚合酶进行PCR反应时，变性往往在94~950C条件下进行。为了使大分子模板DNA充分变性，有人在PCR的第一个循环中把变性时间延长为5min。但也有人认为对于线性DNA来说，这种延长不但没有必要，而且有害。因此，对于C+G含量55%的线性DNA模板，常规PCR的变性条件是94~950C变性为45s。当模板DNA的G+C含量＞55%时要用更高的变性温度。（二）退火退火是引物和模板DNA复性。复性过程采取的温度（Ta）至关重要。复性温度过高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率很低。复性温度太低，引物将产生非特异性复性，导致非特异性的DNA片段的扩增。虽然退火温度可以通过理论计算出来，但没一个公式适用于所有长度和不同序列的寡核苷酸引物。最好在比两条寡核酸引物的熔解温度低2~100C范围内进行系列预实验来对复性条件进行优化，或者通过控制PCR仪在连续的循环中逐渐降低的复性温度来确定最佳退火温度。一般来说，退火温度通常在比理论计算的引物和模板的熔解温度低3~50C的条件进行（三）延伸即寡核苷酸引物的延长，通常在热稳定DNA聚合酶催化DNA合成的最合适温度下进行。对于TaqDNA聚合酶，最适温度一般为72~780C；在这一温度，TaqDNA聚合酶的聚合速率为2000bq/min。（四）循环数目PCR扩增所需的循环数取决于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩散的效率。一旦PCR反应进入几何级数增长期，反应会一直进行下去，直至某一成分成为限制因素。对于TaqDNA聚合酶，在一个含有105个拷贝的靶序列的反应体系中进行30次循环后就能达到上述的理想情况。4.PCR技术的应用（1）遗传性疾病的基因诊断一般按一下几种方式进行：1根据特异性扩增带缺失做出诊断；2根据RFLP（限制酶片多段长度多态性）连锁分析作出诊断；3根据寡核苷探针斑点杂交进行基因诊断。临床上常用于家族性的遗传病、产前胎儿性别及伴随性遗传病的诊断。[5]1988年Chamberlain首次将多重PCR应用于杜氏肌营养不良症（Ducennemusculardystrophy,DMD）的检测，后来用于Becker型肌营养不良症的检测。1969年Newton等最早提出了用等位基因特异PCR（allele_specificPCR）检测人抗胰岛素基因缺陷。缺口PCR（gapPCR）可用于地中海贫血的筛查。PCR还广泛应用于怀孕早期诊断，防止有遗传性疾病婴儿出生，有利于优生优育，提高人口质量。（2）用于传染和流行病的检查PCR在临床上的应用主要是检测病原体，包括患者是否受到某种病原体的感染，食物中各种病原体的含量是否超标。有多种PCR方法可以用来检测病原体，原则上讲凡是已知有特异标记的病原体都可用PCR进行鉴定。可用PCR检测的病原体包括各种细菌、病毒、沙眼衣原体、支原体、寄生虫等。AIDS病由人免疫缺陷病毒HIV感染所致获得性免疫缺陷综合症。HIV-1是一个多态性RNA反转录病毒。该病毒感染细胞后依靠自身的反转录酶反转录为相应的DNA并整合到宿主细胞染色体上，以此为基础进行复制。在计算机的帮助下针对保守性很强的序列设计出一些引物。通过PCR技术就可以早期查出是否已感染AIDS病毒，包括去年发生的SARS病毒。[3]（3）在肿瘤研究中的应用PCR也已广泛应用于肿瘤的病因与发病机制研究以及肿瘤诊断与治疗的研究。例如，用差异显示PCR能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物。用于早期诊断、判断预后及疗效评估。化学治疗，放射治疗和骨髓移植使癌症患者的存活率明显提高，不过，复发的分先仍然是完全治愈的显著障碍。这样，用定量PCR检测微量小残留病灶成为进一步改进治疗水平上出现的反应作出治疗决定。癌症的起因最终也可归结于单个细胞的子的改变，从而引起细胞的正常生理发生改变，导致细胞的异常繁殖。单细胞PCR能找到单个细胞内的分子改变情况，从而促进对肿瘤的病因及发病机制的研究。（4）在基因分型中的应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequencespecificoligonucleotidepolymorphism,PCR-SSOP）常用于对人类白细胞抗原（humanleukoucyteantigen,HLA）进行分型。当患者需要进行骨髓或器官移植时，首先必须进行组织配型工作。如果捐受双方遗传基因型相符合，那么受者发生“排斥反应”的概率减小，移植的成功率也相对提高。因此，捐受双方遗传基因型检测的准确度是关键。PCR-SSOP法可提供精确配型，使骨髓移植成功率急速跃升。PCR-限制性片段长度多态性也可用于HLA的分型，用于器官移植免疫学。PCR除了用于对人类白细胞抗原进行基因分型外，还广泛应用于微生物、昆虫、植物和动物。微生物分型可用于流行病学调查。对动植物的基因分型可对物种亲缘关系进行鉴定。Black等率先将任意引物PCR，结果表明，根据电泳图谱能明确区分4个种。PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP）是一类更为精细的技术，它可以区分某一个基因内单个核苷酸的差异，被广泛应用于细菌、病毒及寄生虫等的分类，它不仅可区分不同的种，而且能把同一种的不同株区分开来。[4]（5）在法医学上的应用DNA分析技术在法医学中的应用取得了重大的进展。法医学应用DNA分析目的有：性别鉴定、个人识别和亲子鉴定和发现罪证。比如0.1uL的唾液痕迹所含的DNA就可以通过PCR扩增而获得足够量的DNA进行测序识别罪犯。因此毛发、血迹、唾沫、精液都可以成为重要的罪证。利用PCR技术可以进行性别鉴定。选择适当的引物，对男性Y染色体DNA特异的序列进行特异的扩增，如选择Y染色体E号卫星区域的重复序列（DYZ1）、Y染色体DNA中的性别决定基因的SRY等，根据有无特异性扩增产物来判断性别。为防止扩增时出现假阳性结果，可同时用其他引物扩增男女共有的DNA序列，如人类共有的Alu重复序列，X染色体特异序列等作为阴性对照。另外，结合杂交等其他方法，使得DNA分析技术在法医学中的应用取得了重大进展。个人识别、亲子鉴定都是基于由于人类的基于具有多态性。DNA多态性可以分为两大类，一类为序列多态性，另一类为长度多态性。1979年jeffyeys等建立了DNA指纹技术（DNAfingerprintingtechnique），并于1985年首次应用于法医学鉴定。自此，物证检验实现了从血型分析只能排除不能认定，到DNA分析个人认定的飞跃。PCR技术应用到DNA指纹技术后，使得法医学检验中的微量痕迹检测的灵敏度大大提高，而且对于检测长达10年的精斑，尸骨、分析高温烹过的组织都没有问题，因而获得广泛应用。由于DNA指纹具有非常强的个体特异性，其个体相关概率为4X10-12，也就是现今世界人群中（5X109）除了同卵双生子外，没有DNA指纹相同的人。通过家系分析表明，DNA指纹图中的杂交谱带是按孟德尔遗传定律遗传的，孩子的谱带一半来自母亲，另一半来自父亲，而新带的概率仅为0.001%~0.004%。正因为