发酵过程中微生物利用单糖的差异性

书书书中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（９）：１０２～１０７发酵过程中微生物利用单糖的差异性朱　豫１，２　曹海龙１，２　李曙光１　白雪芳１　杜昱光１（１中国科学院大连化学物理研究所　大连　１１６０２３　２中国科学院研究生院　北京　１０００４９）摘要　考察了多种发酵常见微生物对单糖的利用差异（尤其是葡萄糖／果糖利用差异）。并在分子生物学层面，从转运和磷酸化两个角度分析了造成这种差异的原因。通过定位与此相关的特殊操纵子或编码基因，能够帮助实现工业微生物的改造，从而使多种非葡萄糖基生物质能源得到有效利用，对能源模式的转化和可持续发展有着重要意义。关键词　单糖　利用差异　转运　磷酸化　生物质能源中图分类号　Ｑ８１５收稿日期：２００９０３２０　　修回日期：２００９０４２１中国科学院知识创新工程重要方向项目（ＫＳＣＸ２?ＹＷ?Ｇ?０１２）、中国科学院知识创新工程领域前沿项目（Ｋ２００６Ａ８）资助项目通讯作者，电子信箱：[e-mail]　　能源是现代社会赖以生存和发展的基础。持续、稳定的能源供应和高效、清洁的能源利用，是我国实现经济可持续发展的基本保证，也是国家战略安全保障的基础之一。大量消费化石能源所排放的ＳＯ２和ＣＯ２已严重威胁人类赖以生存的生态环境，不可再生的化石能源正面临枯竭的危险。　　生物质能源的利用和实施便应运而生，并迅速成为各国政府和研究机构能源战略的研究焦点。为此，欧美许多国家结合本国特点制定了生物质能源的发展纲要，在推广使用上出台了相关的优惠政策推动生物质能源发展［１］。例如美国和巴西以玉米和甘蔗生产燃料乙醇；欧洲以油菜为原料生产的生物柴油等都取得了成功，为传统的生物质产业洞开了一个新的替代性能源窗口［２］。　　常见的生物质能源多来源于碳水化合物基原料，大致分为以下几种：糖质原料（ｓｕｇａｒ?ｂａｓｅｄｆｅｅｄｓｔｏｃｋ），淀粉质原料（ｓｔａｒｃｈ?ｂａｓｅｄｆｅｅｄｓｔｏｃｋ），菊粉质原料（ｉｎｕｌｉｎ?ｂａｓｅｄｆｅｅｄｓｔｏｃｋ），木质纤维素类原料（ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）和乳清、纸浆废液等工业废料。这些原料预处理后经酸解或酶解后形成的单糖或由这些单糖聚合成的低聚寡糖可被微生物利用，作为维持生长和进一步生物转化的碳源。原料作物千差万别，但水解后得到的单糖多为葡萄糖、果糖、木糖、核糖、阿拉伯糖等。不过，微生物利用它们的效率是不同的。高浓度碳源还可能对微生物生长产生抑制［３］。以木质纤维素为例，其主要成份之一半纤维素容易被水解，产物的８５％～９０％为木糖［４］。酿酒酵母是传统的乙醇生产菌株，缺乏转化木糖的酶系，但能发酵其异构体木酮糖。因此构建利用木糖产乙醇的重组酵母有两个策略：一是在酿酒酵母中克隆并表达木糖还原酶基因ＸＹＬ１和木糖醇脱氢酶基因ＸＹＬ２；二是克隆并表达木糖异构酶基因ＸＹＬＡ［５］。研究显示在酿酒酵母中表达来自嗜热菌Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ的木糖异构酶基因ＸＹＬＡ而建立了的木糖代谢途径后，使其能够以木糖为唯一碳源进行限氧发酵，木糖利用率为宿主菌的４．１７倍［６］。类似地，蔗糖、菊粉水解后产生大量的果糖、果糖与葡萄糖浓度比甚至高达３～４。发酵工业所用的微生物能否有效地利用果糖，为这类碳水化合物基能源植物的开发利用提出很大挑战。１　单糖利用的差异性　　即便微生物细胞质内具备代谢单糖的酶系，但利用不同单糖积累的生物量和代谢产物量却不尽相同。尤其是发酵过程中果糖基碳源和葡萄糖基碳源的利用差别（Ｇ／Ｆｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｙ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎｏｆｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｆｒｕｃｔｏｓｅ）。对此的关注始于酿酒过程中的一个问题，即葡萄酒原料———葡萄原汁中含几乎等量的葡萄糖和果糖，而酿酒酵母发酵葡萄糖的速度稍快于果糖（Ｋｏｔｙｋ，１９６７和Ｃｉｒｉｌｌｏ，１９６８分别发现酿酒酵母Ｓ．２００９，２９（９）朱　豫等：发酵过程中微生物利用单糖的差异性ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ对葡萄糖的亲和力是果糖的５倍和１０倍），导致发酵液中较高的果糖／葡萄糖浓度比率（!３），使发酵液粘度增加。此外，果糖甜度是葡萄糖的２倍左右，令发酵液甜味增加而影响酒的风味口感。在其他发酵过程中也有类似现象。例如柠檬酸发酵时，黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）在生长后期利用果糖就明显慢于葡萄糖［７］；酿酒酵母发酵产生乙醇后期，果糖的利用对维持发酵高效进行至关重要［８，９］。此外，很多微生物，如丝状真菌ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉ（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ，Ｐｙｒｅｎｏｐｅｚｉｚａｂｒａｓｓｉｃａｅ），面包酵母ｂａｋｅｒ’ｓｙｅａｓｔ，子囊菌ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ等，都有报道对葡萄糖更有倾向性。葡萄糖被公认为“能被微生物最有效利用的己糖”。　　早期研究以模式生物大肠杆菌的单糖转移酶为出发点。２０世纪７０年代初，Ｆｅｒｅｎｃｉ等［１０］就研究了大肠杆菌的果糖利用途径。此后，Ｋｏｒｎｂｅｒｇ和Ｒｅｅｖｅｓ考察了大肠杆菌中磷酸烯醇丙酮酸依赖的己糖磷酸转移酶活性，发现它与己糖利用有很大关系［１１］。１９７４年，Ａｄｌｅｒ等［１２］发现大肠杆菌中有两种性质不同的磷酸转移酶ＩＩ，作为Ｄ?葡萄糖和其类似物的转运受体。而Ｊｏｎｅｓ?Ｍｏｒｔｉｍｅｒ等［１３］对大肠杆菌中与果糖利用相关的基因进行研究，在基因组中定位了介导果糖分别转化为果糖１磷酸和果糖６磷酸的磷酸烯醇丙酮酸－磷酸转移酶系统。　　后来，逐渐有学者借助代谢动力学从自然界或突变／诱变的微生物中发现一些倾向利用非葡萄糖基碳源的微生物，为这类研究提供了契机［１４，１５］。普遍认为，细胞外单糖或寡糖经由细胞膜上的转运系统（转运子）转移到胞内，然后在细胞质内磷酸化或异构化，进入经典代谢途径。磷酸化后的果糖和葡萄糖可以通过异构酶互相转化，在经典途径中代谢速度差别不大；木糖可在木糖还原酶和木糖脱氢酶作用下生成木酮糖或通过木糖异构酶直接生成木酮糖，再经木酮糖激酶作用生成５?磷酸木酮糖，进入戊糖磷酸途径。所以，微生物消耗不同单糖的速率不同，可能因为：一、细胞膜上单糖转运子的特异性；二、磷酸化（激酶）的差异。２　单糖转运子　　８０年代，Ｂｉｓｓｏｎ等［１６～２０］对酿酒酵母的葡萄糖转运机制以及系列相关调控基因展开了系列研究。发现细胞膜上存在非专一性的己糖转运子。酿酒酵母中己糖转运子的编码基因是ＨＸＴ基因（ＨＸＴ１至ＨＸＴ７）。这类转运子既能转运葡萄糖，也能转运果糖。现有研究总结，Ｈｘｔ１和Ｈｘｔ３对己糖表现出低亲和力，而Ｈｘｔ６和Ｈｘｔ７亲和力相对较高［２１］。　　Ｓａｂｉｒｅ等将ＨＸＴ基因的表达分为三种类型：（１）葡萄糖诱导表达，却不依赖于浓度的转运子基因（ＨＸＴ３）；（２）低浓度葡萄糖诱导表达，高浓度抑制表达的转运子基因（ＨＸＴ２和ＨＸＴ４）；（３）高浓度葡萄糖才能诱导的己糖转运子（ＨＸＴ１）。而这四个ＨＸＴ基因表达受Ｒｇｔ１ｐ和Ｓｓｎ６ｐ等的调控（图１）［２２］。　　在酿酒过程中亲和力高和亲和力低的转运子都有表达，发酵初期，主要表达低亲和力的Ｈｘｔ１基因，在发酵中期（生长停滞期），Ｈｘｔ６和Ｈｘｔ７表达［２３］。图１　三种葡萄糖转运的调控机制［２２］Ｆｉｇ．１　Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｖｅｌｓｏｆｇｌｕｃｏｓｅ（ａ）ＨＸＴ３（ｂ）ＨＸＴ２ａｎｄＨＸＴ４（ｃ）ＨＸＴ１　　不过，人们在自然界中也陆续发现许多微生物倾向利用果糖甚于葡萄糖，并把这种倾向性称为“ｆｒｕｃｔｏｐｈｉｌｙ”，而且研究发现它们往往具有一些特殊的、有果糖专一性的转运子。Ｓｏｕｓａ?Ｄｉａｓ［２４］在１９９６年发现一株利用果糖速度比葡萄糖快的拜尔结合酵母（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｂａｉｌｉｉ），该株酵母中含有一个高转运量，低亲和力的特异性果糖转运子。２００４年，Ｃａｒｌｏｓ等［２５］进一步确定Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｂａｉｌｉｉ的果糖特异性转运子Ｆｆｚ１（ｆｒｕｃｔｏｓｅｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒｏｆＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）的基因编码。他们将Ｚ．ｂａｉｌｉｉ的基因组转导至一株不能利用己糖的酿酒酵母（ｈｘｔ?ｎｕｌｌｓｔｒａｉｎ）中，结果是该酵母可以在果糖培养基上生长，而无法利用葡萄糖。　　２００５年，Ｇｕｎｔｈｅｒ等学者发现一种灰霉病真菌Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ的增殖和对植物的侵染是受单糖刺激的。而果糖比起葡萄糖更容易诱导该菌增殖。在此机制中，果糖转运子ＦＲＴ１起到了关键的作用。它对果糖３０１中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．２９Ｎｏ．９２００９有高亲和力，具有专一性，无法转运葡萄糖。ｆｒｔ１突变了的Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ与野生型相比，虽然生长和对植株的侵染没有区别，但果糖诱导的增殖却明显延缓［２６］。　　除了这些专一转运果糖的转运子，Ｃａｒｏｌｅ等［２７］学者在２００７年研究了一株能以果糖为碳源发酵的商用酵母时，通过考察几个己糖转运子（ＨＸＴ）基因，发现ＨＸＴ３等位基因发生了突变，使其果糖利用能力增强。　　己糖转运子之间具有同源性。上述提及的转运子ＦＲＴ１的部分氨基酸序列与Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ等［２８］在２０００年发现Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ中一个编码果糖特异转运子ＦＳＹ１很相似。但与非专一转运子ＨＸＴ基因相似度却不高。这种转运子之间的同源性和序列相似性大多体现在跨膜区域和信号转导区域［２６］（图２）。图２　己糖转运子之间的同源性系统图［２６］Ｆｉｇ．２　ＤｅｎｄｒｏｇｒａｍｓｈｏｗｉｎｇｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙｏｆＢ．ｃｉｎｅｒｅａＦＲＴ１ｔｏｏｔｈｅｒｆｕｎｇａｌｆｒｕｃｔｏｓｅａｎｄｈｅｘｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ　　此外，一些戊糖，如木糖，也能通过一些葡萄糖转运因子介导进入酵母细胞［２９］。但葡萄糖对木糖的转运和利用有阻遏作用，因此异源表达专门转运木糖的转运子基因是十分有用的。Ｌｅａｎｄｒｏ［３０］从中间假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）中分离出第一个编码葡萄糖／木糖同向转移因子的基因，并且在酿酒酵母中得到了成功表达。Ａｎｕ利用已经删除了７个己糖转运子基因的酵母菌株对能高效代谢戊糖的丝状真菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ的ｃＤＮＡ进行筛选，得到一个与真菌的糖类运输因子高度同源的ｃＤＮＡ克隆。带有该克隆的重组酵母菌株突变后，得到专转运木糖的蛋白因子Ｔｒｘｌｔ１，这为木糖转运因子的克隆表达提供了一个新的来源。３　磷酸化（激酶）　　己糖的利用过程中，转运和磷酸化实际上是密不可分的。磷酸化是伴随着转运过程发生的。细菌中己糖的转移是经由磷酸转移酶系统（ＰＴＳ）通过锚定于膜上的酶ＥＩＩ的催化，将胞外单糖转运到胞内，再在一系列酶反应（ＥＩ，Ｈｐｒ，ＥＩＩＩ）作用下，把磷酸烯醇式丙酮酸变为丙酮酸过程中释放的磷酸基团转移到单糖上使其磷酸化［３１］（图４）。一般ＥＩＩ有三个区域：ＥＩＩＡ和ＥＩＩＢ位于细胞质内，参与到磷酸基团的转移；ＥＩＩＣ部分锚定在膜上，负责转运单糖。图４　ＰＴＳ介导的单糖转运系统［３１］ＦＩＧ．４　ＳｕｇａｒｔｒａｎｓｐｏｒｔｂｙｔｈｅＰＴＳＡｇｅｎｅｒａｌｐｈｏｓｐｈａｔｅｔｒａｎｓｆｅｒｃｈａｉｎ（ｅｎｚｙｍｅＩａｎｄＨＰｒ）ｃａｔａｌｙｚｅｓｔｈｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｒｏｕｐｓｆｒｏｍｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ（ＰＥＰ）ｔｏｓｕｇａｒ?ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ（ｅｎｚｙｍｅＩＩＩａｎｄｔｈｅｉｎｔｅｇｒａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎＩＩ）　　１９９３年，Ｓｔｉｇ等［３２］研究发现一株乳酸链球菌Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ中有两个磷酸转移酶系统（ＰＴＳ）介导果糖的转运。一个是组成型甘露糖?磷酸转移酶系统，为非专一性转运，将果糖磷酸化为果糖?６?磷酸；另一个是诱导型果糖?磷酸转移酶系统，转运的果糖被磷酸化为果糖