real-time实验报告

Real-timePCR（RT-PCR）实验报告贰零零九年十月二十七日实验报告内容包括：1材料和方法1.1主要试剂1.2主要仪器1.3主要试剂的配制2.总RNA的提取和鉴定2.1总RNA的提取2.2总RNA纯度和浓度的测定3.cDNA第一链合成:4.引物设计及PCR反应5.结果分析1材料和方法1.1主要试剂Trizol®ReagentInvitrogen公司ReverseTtanscriptionSystemPromega公司DEPCSigma公司TaqpolymerasePromega公司dNTPMix（10mM）Promega公司DNAMarker（DL2000）TIANGEN公司琼脂糖Sigma公司氯仿上海试一化学试剂有限公司异丙醇上海试一化学试剂有限公司引物合成上海生工溴化乙锭Amresco公司1.2主要仪器PCR仪BIO-RAD公司RNA/DNAcalculatorPharmacia公司凝胶成像系统上海四星生物技术有限公司电热恒温水槽上海精宏实验设备有限公司高速冷冻离心机BECKMAN公司DNA水平电泳仪BIO-RAD公司电子天平上海精科天平厂1.3主要试剂的配制1.3.1Tris-硼酸(TBE)电泳缓冲液配方:5X:54gTris碱27.5g硼酸20ml0.5mol/LEDTA(ph8.0)加水稀释至1L。使用时稀释成0.5XTBE1.3.26xDNA上样缓冲液配方:0.25%(w/v)溴酚蓝0.25%(w/v)二甲苯青FF30%(w/v)甘油水溶液1.3.3用于配制试剂的DEPC-H2O双蒸水1000ml加DEPC1ml，于磁力搅拌器上搅拌2hr，然后高温高压湿热灭菌,备用。1.3.475%酒精125mlDEPC-H2O加375ml无水乙醇，混匀。2.总RNA的提取和鉴定2.1总RNA的提取抽提RNA时，首先应确保室内清洁无污染，空气处于静止状态，并用75%的酒精对实验台及所需试剂、实验器材及实验者本身进行消毒处理。准备完毕方可按照Trizol®Reagant试剂制造商提供的步骤进行总RNA提取实验。实验步骤简述如下：（1)50mg组织中加入1mlTRIZOLReagent，充分匀浆。（2）将匀浆液室温静置5min，加入200μl氯仿，来回颠倒混匀15sec，室温静置2-3min，4℃12000r/min离心15min；（3）小心转移上层水相于一新的1.5ml灭菌除酶的离心管中，加入0.5ml的异丙醇室温静置10min，4℃12000r/min离心10min，小心弃上清。白色沉淀为RNA；（4）RNA洗涤:加入1ml75%的酒精，充分振荡以洗净其它杂质，4℃7500r/min离心5min，小心弃上清；（5）RNA再溶解:将离心管小心倒置放于高温灭菌的抽提纸上自然干燥10-15min，加入DEPC水30μl溶解。2.2总RNA纯度和浓度的测定采用紫外分光光度法，测定RNA样品在波长260nm和280nm的紫外吸收值。根据OD260为1时相当于RNA40μg/ml确定RNA的量，通过下述公式计算RNA的浓度：RNA(μg/μl)=OD260×40×100/1000同时，计算OD260和OD280的比值（OD260/OD280），当两者比值在1.8-2.0时，说明提取的RNA纯度高，无蛋白质和DNA的残余。通过测定，检测出各样品A260/A280的值如下：OD260/280:1.811.821.881.911.771.801.951.811.821.881.911.771.831.931.811.881.961.771.831.921.811.801.851.911.751.831.951.941.871.941.791.791.961.811.821.881.911.771.831.951.861.861.811.771741.881.981.821.861.861.951.771.831.951.821.881.911.771.831.871.811.841.881.891.841.831.95顺序按Realtime名字.3.cDNA第一链合成:（1）首先在0.2mlPCR管内加入以下试剂：总RNA2μlOligo(dT)18Primer(0.1ug/ul)1μl0.1%DEPC水8μl将上述样品混匀离心数秒后，于70℃反应5min；然后立即转至冰上2-3min；（2）在以上混合液中再加入以下试剂：M-MLV5×Buffer4μldNTPMix（10mM）4μlRNaseinhibitor0.5μlM-MLV-RT1μlTotalvolume20μl将反应液置37℃60min,70℃加热10min灭活,冰上冷却。所得cDNA第一链产物置-20℃保存，待作PCR.4.引物设计及PCR反应首先在genebank中找到所研究基因的cDNA序列，然后于开放阅读框（ORF）保守区域，运用PrimerPremier5结合Dnastar分析软件及网上BLAST分析，设计并合成以下引物，引物序列如下：Real-timePCR反应体系:10ul---subgreenmix：5ul,primerF(5uM)：1ul,primerR(5uM)：1ul,cDNA：3ul.2.Real-timePCR程序：Step1:50℃2minStep2:95℃10minStep3:95℃15secondStep4:60℃1min转至step3