RG6000荧光定量PCR仪售后培训手册

1基因有限公司生命科学组Rotor-Gene6000荧光定量PCR仪培训手册2目录一．RotorGene6000荧光定量PCR系统介绍1二．系统安装与维护4三．培训所需试剂、仪器及耗材5四．培训程序及日程安排6五．实验操作流程7六．软件使用培训9七．常见问题解答18八．Rotor-Gene系统设置注意事项21九．相对定量方法简介—Rotor-Gene上的实际操作223一、RotorGene6000荧光定量PCR系统介绍CorbettResearch公司是著名的专业研制和生产生物仪器的厂家，产品主要包括Rotor-Gene离心式实时定量PCR仪、CAS-1200自动加样系统等。公司自成立以来一直致力于定量PCR相关仪器的研究开发，将创新技术与精美工艺相结合，在仪器的性能、软件、外观上不断改进，推出临床、科研领域的佼佼者，真正的匀速离心式实时定量PCR仪——ROTOR-GENE6000荧光定量PCR系统。1．系统技术参数型号62006200HRM65006500HRM6600通道数22+155+16激发光源22+155+16检测滤光片22+155+16可检测荧光FAM™,SYBR®GreenI,Fluorescein,EvaGreen™,AlexaFluor®448;JOE™,VIC™,HEX™,TET™,YakimaYellow®,CalGold™,AlexaFluor®532;LCGreen®,LCGreen®Plus+(HRM)在6200础上增加ROX™,Cy3.5™,RedmondRed®,AlexaFluor™568;Cy5™,Quasar670™,LCRed650®,TexasRed®,CALFluor™Red590;Quasar705™,LCRed705®,AlexaFluor®680;LCGreen®,LCGreen®Plus+(HRM)在6500基础上增加BiosearchBlue™,MarinaBlue®,BothellBlue®,AlexaFluor®350HRMN/AYESN/AYESN/A转速400rpm控温范围室温-99℃温度变化速率10℃/秒温度均一性±0.01℃温度分辨率0.02℃样品量0.2ml×36，0.1ml×72，30ul×100尺寸370mm宽，420mm深，560mm深（开门），275mm高电源100-120VAC@60Hz，200-240VAC@50HzRotor-Gene是一套实时显示DNA扩增和杂交过程的循环变温系统。该装置能在其36孔转子上容纳36个0.2ml的标准离心管。72孔转子配有0.1ml四联管，并可选配72孔及100孔的GeneDisk™。42．Rotor-Gene创新的系统结构独特的离心式设计——最佳的温度均一性RG6000秉承了Rotor-Gene一贯的离心式的反应转子设计，反应中样品始终处于低速匀速转动中，保证各样孔相对位置的完全一致。从而排除因样孔相对位置差异和反应模块边缘效应引起的温度不均一性。高效的热力学结构——无需平衡时间升温时，顶部金属加热器加热封闭的反应舱空气，降温时，底部强力排风扇迅速排出热空气，同时打开顶部气孔，达到快速空气交换。开放式转子设计，保证快速的热交换，相比其它定量PCR系统，运行速度更高。巧妙的光学设计——无需ROX内参及光学补偿优化的独立的LED激发光源，保证最小的光谱交叉，离心式的模块保证每个样孔受到完全均一的激发。新的RG6000在RG3000的基础上又对光路进行了改进，使光路更加稳定，仪器的结构变得更紧凑。ReactionChamberPMTDetectorAssemblyLEDLightSourceAssemblyTubesinRotorSpinPastOpticsLensDetectionFiltersSpindle/MotorAssembly5开放的系统——低廉的运行成本适合所有定量PCR标记方法：如SybrGreen,Taqman,MB,FRET,QuenchedFRET,Ampliflour等。开放的试剂系统：无需特定的酶和试剂，使用绝大部分厂家提供的酶和反应体系。无需内参和特殊反应容器：固定的光程和最小的光学交叉，无需内参校正系统；PCR管壁检测，普通PCR管即可满足要求。遗传学分析的最新方法——新增HRM功能RG6000有两款带有HRM功能的型号。无需序列特异型探针，仅用价格低廉的染料即可对片段进行基因型分析。其它专利技术光学变性技术：有助延长酶活性，同时缩短反应时间。自动温度校正：足不出户，便可对温度进行自动校正。6二、系统安装与维护1.安装条件1).位置要求：稳定水平的操作平台放置设备，远离热源，避免阳光直射2).空间及载重要求：3).RG6000主机：370mm宽，420mm深（560mm开门），275mm高4).重量：14Kg（此外，还需要有放置配套电脑的空间及载重）5).温度要求：15-35℃6).电源：90-250VAC7).其它：通用插头接线板2.维护用户唯一需要做的维护措施是保持透镜清洁，避免灰尘积累。建议在不使用Rotor-Gene时，盖子要盖好以免灰尘落进加热腔中。反应舱下部和侧壁有仪器的光学组件，有灰时可以用吸耳球将灰尘吹出，或用沾有无水乙醇的棉签清洁。7三、培训所需试剂、仪器及耗材1.试剂1).HBVDNA试剂盒标准品2).Sybr-GreenI演示试剂盒装机演示时选用其中一种实验试剂完成实验，具体使用哪种试剂根据当时公司备货情况。2.仪器及耗材1).台式离心机2).震荡混匀器3).移液器4).0.2mlPCR反应管，1.5mlEP管，Tip头（进口），乳胶手套等以上物品请用户提前准备妥当，我公司培训人员将使用以上物品进行仪器使用的培训工作。如不具备请及时与培训技术人员联系。8四、培训日程安排请至少安排2名实验室长期工作人员参加培训，以后如有人员变动由客户自行负责。1.Real-timePCR原理及应用讲座2.RG6000仪器简介3.仪器安装及使用培训4.定量PCR演示试验5.软件基本功能综述及使用培训9五、实验操作流程实验目的：验证机器的重复性、扩增线性及了解机器和软件的使用及其特点。荧光定量PCR反应操作流程（以市售HBV病毒检测试剂盒为例）：1.开机，根据试剂盒条件设置好PCR反应条件2.配置PCR反应混合液3.实验设计体系为：4个浓度梯度稀释的标准品，1-2组上述样品重复组，1个阴性对照4.除演示外，用户可自己操作完成一次实验方法：1.Taqman法1).在一个管中混合：（20μl体系）HBVPCRBuffer（含探针及引物）N×15μlTaq酶N×0.2μl（为了防止分液后最后一个管液体不足，N为实际PCR体系数加一。做四个标准品，一个阴性对照，其中一个标准品设置两组重复组，共7个样品，则N为8）混合液混匀，离心（去除气泡），向每个PCR反应管中分装15μl。2).每管加等量DNA样品或阴性对照（ddH2O）5ul*，混匀，离心，立即置于RG6000荧光定量PCR仪，进行PCR扩增反应。*其中四个管依次加经梯度稀释的标准品(使用前混匀，离心)，其中一个加ddH2O,作为阴性对照3).实验条件StageI：hold95℃15分StageII：cycle94℃20秒，58℃20秒，72℃20秒，采集，40个循环2.Sybr-Green法101).反应体系：根据实际试剂盒情况进配制，样品同上2).实验条件StageI：hold95℃15分StageII：cycle94℃20秒，58℃20秒，72℃20秒，采集，40个循环StageIII：melt58-95℃11六、软件使用培训运行Rotor-Gene之前请阅读以下注意事项：保证样品放满36孔或72孔，不足时用空管填满。保证软件设置不在虚拟机状态。尽量使用进口的0.2mlPCR管(0.1ml为CorbettResearch公司专配)，放入转子后加上RG6000专配的压环。用来做填充管的空管如果每次有压环压住可以不更换，但是如果无压环压牢，则需要在2-3次实验后更换新的PCR管，以免管盖弹开。以下是关于配套软件RotorGene60001.7版的简要操作说明。双击软件图标，进入软件操作。软件打开后会自动弹出“NewRun”窗口，选择合适的程序后单击new后，进入“NewRunWizard”操作，按提示要求对每个窗口进行设置，单击Next进入下一页面，完成反应设置。设置一个反应的基本步骤：1．软件打开以后自动弹出“NewRun”窗口（见下图）。选择了合适的程序以后，按New键。12注意，RG6000对各个程序图标的说明与RG3000略有不同。原“Sybr-Green”现在以“IntercalatingDyes”表示，以代表内掺式染；Taqman法在“HydrolysisProbes”表示，以代表所有此类探针；FRET探针以“HybridisationProbes”表示，以代表所有此类探针。HRM方法归入“HRM”文件夹，其它方法归入“OtherRuns”文件夹。以Sybr-Green法为例，选择“IntercalatingDyes”。2．选择所用的转子类型：36孔或72孔，并确LockingRing压好了。然后单击Next进入下一步。3．填入操作者的姓名以及反应的备注信息（这两项可不填），并键入反应体积。按Next进入下一步骤。134．选择“EditProfile”进入程序设置。4.1在“EditProfile”窗口中，通过Insertafter…，Insertbefore…，Remove键增加或删除反应步骤。要更改每个步骤的内容，则先选定该步骤，再对各步骤的温度，时间设置进行更改。Insertbefore：允许在选定的项目之前插入一个步骤，比如在循环体之前加入一个保温过程Insertafter：允许在选定的项目之后插入一个步骤，比如加入一个熔解曲线14Remove：从列表中去除不要的步骤Denature：设置变性温度和时间Cycling：设置循环体Melt：设置起止温度及每一个温度的持续时间在设置“Cycling”内容时，窗口如下；该步除对反应时间，温度进行设置，还需要设定在哪步读取荧光，单击“AcquiringtoCyclingA”或“NotAcquiring”按钮会弹出“Acquisition”对话框，用[]，[]和[]键在两个窗口中移动通道，所有列在右边的通道都是机器运行时要采集信号的通道。按OK键确认结束对话。如果在这个循环步骤不采集荧光，则点击Don'tAcquire键。“IntercalatingDyes”程序默认在“Green”通道采集荧光，可以不进行修改。通过＋，—按钮可以增加或减少Cycling中的步骤。15完成以上设置以后，按OK键结束“EditProfile”编辑。回到上一级窗口。4.2选择GainOptimisation，允许对每个通道的Gain值进行调整。GainOptimisation功能允许设置每一通道的灵敏度。设定反应需要采集荧光的温度，选择在哪一步运行校正程序，然后选择需要校正的通道，按Start键，仪器自动进行校正，完成后按Close结束对话。5．按Next键进入下一步骤，确认了反应设置后，按StartRun开始反应。166．此时会弹出文件保存Saveas窗口，该文件包括一次运行的所有信息。7．选定保存后，自动弹出样品编辑窗口。该操作窗口用于定义放入转轮内的样品。转轮上的数字对应于操作窗口中的样品号。有以下几种样品类型：None：该位置无样品。NTC：阴性对照。Sample：待测样品。Standard：标准样品（已知浓度）。Unknown：代测样品17PositiveControl：阳性对照NegativeControl：阴性对照完全的样品描述可以存储成样品文件，便于以后类似文件的设置。每一样品可以选用不同的颜色代表。样品的浓度单位和计数方法也可以该窗口内设置。该窗口的设置可以在整个反应过程