WesternBlotting实验手册

WesternBlotting实验手册1.Westernblotting实验简介WesternBlotting或称为Immunoblotting，中文名称为免疫印迹。其程序是对经处理的样本（血清、培养细胞和组织匀浆）先进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，以分离蛋白质。然后将电泳后的分离开的蛋白质转移至具有结合力的膜上。对转印膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。最后对膜上蛋白质进行检验。可以得到很多有关被检测蛋白质的信息，如分子量，亚型，是否和其它蛋白质结合等。即可检测出样品的待测抗原并可对其定量.由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，其优点是方法简便、标本可长期保存、结果便于比较，故广泛应用于分子生物学等领域，成为免疫学、微生物学及其他生命科学常用的一种研究方法。2.博士德采用的显色方法更加快捷，更加敏感博士德的Westernblot检测方法主要是采用酶促反应，该反应比同位素安全且快速。同时显色方法的搭配也很多样，可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光和底物显色。化学发光法在暗室即可曝光显色，而且博士德的显色试剂盒用博士德研发的技术，稳定性更强，显色结果更快，长期作为WB实验室检测使用。化学发光法的灵敏度已经达到pg级别，灵敏度超过了同位素；底物显色于直接显色而操作简便且成本低；而底物显色法由于直接在膜上显色而操作简便且成本低，更加的方便快捷，受到客户的广泛青睐。3.HRP辣根过氧化酶标记二抗的灵敏度高，发光持久，可反复曝光，节约抗体的作用博士德的Westernblot检测方法中的二抗是用HRP辣根过氧化酶进行标记的。HRP辣根过氧化酶由于比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和化学显色底物2大类。化学发光底物的主要特点是：灵敏度高（灵敏度已经达到pg级别，甚至还有Femto级别的），发光持久（6-24小时），可反复曝光，稳定性好（室温贮藏6个月，4℃至少是12个月），节约抗体（由于灵敏度高，一抗二抗稀释倍数较高，这对于宝贵一抗来说十分重要）。化学显色底物法采用DAB，AEC，bcip/nbt法显色其中DAB法最常见，DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，需要拍照记录。二．Western步骤：我们为您提供全套免疫印迹(Westernblotting)技术服务，全部实验皆使用高质量试剂完成。1.主要实验步骤如下：一．蛋白样品的制备1.培养细胞蛋白样品的制备（总蛋白浓度1-10ug/ul）：（1）细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化或者细胞刮刀处理，细胞经预冷的PBS漂洗两次，3000r/min离心2-3min。倒掉上清，向沉淀中加入5-7倍沉淀体积的裂解液，反复吹打混匀。（2）若有粘稠物存在用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为2s，间歇2s，功率为100-120w，至溶液无粘稠为止。处理完后置4度冰箱中裂解4-5h。（3）再次超声处理至无粘稠，10000r/min离心10min。去除上层脂类和下层细胞碎片，取中层溶液至以新的离心管，加入等体积的2*Laminin样品缓冲液，强力混匀，样品置100度水浴箱中沸水浴5min，使蛋白质与Laminin缓冲液中的SDS充分结合形成SDS-蛋白质复合物，形成榛状结构。至此样品已准备就绪（样品可立即使用，也可以分装冻存。-20度存放的样品可稳定维持数月，4度可保存1-2星期）2.组织样品的制备（总蛋白浓度1-10ug/ul）：(1)手术切除的组织块迅速置于预冷的生理盐水中，洗去表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块，放入组织匀浆器中，按组织净重（g）：裂解液体积（ml）=1:10的比例加入相应体积的裂解液进行匀浆，至组织研磨完全。(2)超声处理（同细胞蛋白样品的制备），4度裂解4-5h(3)10000r/h离心10min，取中层溶液，加入等体积的2*Laminin样品缓冲液，置100度沸水浴中5min3.蛋白定量常用蛋白定量试剂盒有BCA蛋白定量试剂盒，commassie改良型蛋白定量试剂盒。4.凝胶的制备蛋白分子量(KD)分离胶浓度(%)1008%30～10010%10～3012%1015%1按比例配置分离胶，轻缓摇动8-10下，不要过于剧烈以免引入过多氧气。待凝胶溶液混合均匀，将凝胶溶液平缓注入两层玻璃板中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中影响凝胶的聚合，保持水平，在37度恒温箱中静置1h。2同前按比例配置浓缩胶，摇动时不要过于剧烈，吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入浓缩胶溶液，然后小心插入梳子，并注意齿尖不要有气泡。在37度恒温箱中静置1h时，以保证完全聚合，小心拔出梳子，准备点样。二．点样向电泳槽中加入电泳液，使两块玻璃内侧电泳液高于点样孔，外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部。玻璃板内侧液面高于外侧。然后开始点样，注意加样时间尽量短。电泳加样完毕，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，并选择适当的电压进行电泳。通常在不连续的系统中，上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶电泳电压，以达到更好的浓缩效果，使样品进入分离胶时处于同一水平线上。电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳，电泳时间2-3h。三．染胶电泳完毕可通过考马斯亮蓝染色检测电泳是否成功将凝胶取出放入盒中，倒入少量染色液，以浸没凝胶为宜，在摇床上震荡，直到胶上出现明显条带为止，一般5h或过夜，然后倒去染色液，用脱色液洗涤，期间换1-2次脱色液，直至颜色清亮，背景清楚为止。四．转印湿式电转印1.电泳结束后取出凝胶，在Tris/甘氨酸转印缓冲液中漂洗数秒。取凝胶方法：用刀片将两块玻璃板分开，将上层浓缩胶划去。2.打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海绵垫，再各放一块转印液浸透的三层滤纸，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹，注意NC膜与胶，NC膜与滤纸，滤纸与胶之间不能有气泡。3.转印槽加满电转印缓冲液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内（-20度），连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极4.转印选择恒流，每个转印槽建议电流为150mA,转印完毕可用丽春红S染膜，检测转印是否成功转印结束后，将NC膜置于丽春红S溶液中，室温5-10min即可看见红色条带，用TBS洗数次即可洗掉红色条带进行后续实验五．封闭1.洗转印膜：室温漂洗3次*10min，以尽量洗去膜上的SDS，以防止影响后面抗体的结合。2.取漂洗过的转印膜，放入5%脱脂奶粉的封闭液内，摇床摇动，4度封闭1.5h。3.常用的封闭液有0.2%的TWEEN-20,3%BSA,10%马血清，5%的脱脂奶粉六．抗体的杂交主要采用间接法，即先加入未标记的特异性抗体（Ab1）与膜上的抗原结合，再加入HRP（或生物素）标记的抗抗体（Ab2）进行杂交检测。1.向封闭后的杂交膜加入抗体稀释液稀释后的一抗，盖上保鲜膜，四度孵育过夜。2.TBS-T洗膜3-6次*10min3.加入抗体稀释液稀释的标记的二抗，4度孵育2h，洗膜3-6次，每次10mins。七．检测根据标记二抗的标记物的不同，其杂交的结果检测方法也不同，常用的检测系统有HRP标记的Ab2的增强发光（ECL）和DAB检测系统。DAB检测系统：1.DAB显色液的配制：按照1ml水加显色剂A.B.C各一滴混匀2.显色：将适量的DAB显色液平铺在Ab2杂交后的印迹膜上，室温放置观察，可出现明显的棕褐色蛋白显色带。3.终止：用Tris-Hcl缓冲液或水漂洗即可终止反应。ECL法：利用HRP催化化学发光物质，生成一种不稳定的中间物质，其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带，利用胶片感光原理，将结果记录下来1.ECL显色试剂配制：按1ml水加入ECL底物A.B各50ul混匀2.在暗室将杂交后的印迹膜放于玻璃板上（显色盒），以混合好的显色底物覆盖1-5min3.用一透明的玻璃纸盖住印迹膜抚平，把X光片放在玻璃纸上印迹膜所在地方。4.胶片曝光几秒到数分钟，冲洗胶片以确定所测抗原的正确曝光时间5.冲洗胶片的步骤：曝光完的胶片先在显影液中冲洗至出现条带为止，一般在1min以内，再放入定影液中漂洗，十秒即可。6.记录结果。Westernblot实验注意事项一组织样品的制备：按组织净重（g）：裂解液体积（ml）=1:10的比例加入相应体积的裂解液（加入PMSF使其终浓度为1mM，适当浓度的蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂以免内源性酶分解蛋白，影响蛋白质的抽提）进行匀浆。蛋白质的样品制备是westernblotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求可得获得所有蛋白质，应注意以下问题：1.在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。2.选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价二硫键，使其形成各自多肽的溶液。3.尽量去除核酸，多糖，脂类等分子的干扰，在裂解完毕离心之后小心取中层澄清溶液，注意不要吸到底层沉淀和上层脂类。4.防止蛋白在处理过程中的人为修饰，制备过程必须在低温下进行，以避免细胞破碎释放出得各种酶类的修饰。（可以加入PMSF等酶抑制剂）5.样本制备完后分装保存，但是注意不要反复冻融二凝胶的制备均一胶的制备，分子量较小的蛋白选用较大浓度的凝胶。30%的PAG配置完后过滤四度保存。10%sds室温保存。AP不稳定，用时现配。制胶关键是聚合时间，分离胶聚合控制在从加入10%AP和TEMED起至开始凝胶的时间为10-20min（未完全凝聚）。浓缩胶最佳聚合时间为8-10min开始聚合。可通过控制AP和TEMED量来控制。AP，TEMED的量过高，局部胶凝的太快，会使凝胶不均匀，电泳蛋白条带会弯曲。环境温度较高时，应减少AP，TEMED的量。空气中氧气会影响胶的聚合，所以在分离胶上面应加一层水或正丁醇以隔绝氧气。三电泳常见问题：1条带出现“微笑”现象（中间凹两边翘起）：主要是凝胶中间部分凝固不均所致，应待凝胶充分凝固后电泳，或者催化剂加入后没充分混匀。2条带出现“皱眉”现象（中间鼓坡两边向下）：两玻璃板之间底部气泡所致，应排除底部气泡。3带出现拖尾现象：主要是样本溶解效果不佳；分离胶浓度过大，电泳缓冲液放置时间过长。建议：加样前离心，选择适当的样本缓冲液，加适量的样品促溶剂；使用新配置的电泳缓冲液，降低凝胶浓度或使用梯度凝胶。4蛋白条带出现纹理现象：样品不溶性颗粒引起的：加样前离心，加入适量的促溶剂5指示的溴酚蓝已跑出底板，但蛋白质未跑下来：与缓冲液和分离胶的浓度有关。更换正确的PH值的缓冲液，降低凝胶浓度或使用梯度凝胶八．转印湿式电转印转膜注意事项：转移缓冲液，膜的选择至关重要1.要使蛋白质组分能有效的从凝胶转移到固相纸膜上，缓冲液的PH值很重要。有些分子量不是很大的蛋白质区带，即使延长电转印时间也不能从凝胶转移到膜上。这是由于蛋白质在转移缓冲液中恰好处于等电点状态造成的，因此应适当改变转移缓冲液的PH以利于转膜。另外对于分子量较小的蛋白质，可在缓冲液中加入适量甲醇，因为甲醇能促进它们固定在固相膜上。但是对于大分子量的蛋白质，尤其是碱性蛋白质缓冲液中是不宜加入甲醇的，因为甲醇使凝胶孔径变小，不利于分子量较大的蛋白的转移，；甲醇能将结合在碱性蛋白质上的SDS解离出来而使其带正电或呈电中性，蛋白质就更难从凝胶中转移出来。2.电转印膜的选择：有NC膜，重氮化膜和阳离子尼龙膜，PVDF膜。其中NC膜使用的最为普遍，它的蛋白质容量大，可用各种染色方法进行检测，但是它与蛋白质的结合是非共价性的，膜干燥后很脆。此外膜的孔径大小也是考虑的重要因素。目的蛋白30KD以下用0.22um孔径的NC膜，30KD以上用0.45um孔径的NC膜3.转印选择恒流，每个转印槽150mA,10KD以下转印40min，10-30kd转印50min，30-100KD转印70min，