RNAi技术及在植物中的应用-生命基地112-廖仕秒-13211127

RNAi技术及在植物中的应用生命基地112班廖仕秒13211127（南京农业大学生命科学学院，江苏南京）摘要：RNA干扰（RNAinterference）是由dsRNA触发的、针对特定基因的转录后沉默机制（PTGS）。外源性或内源性的dsRNA在RNaseⅢ的切割作用下，形成19~25bp的高度保守siRNA。siRNA与Argonaute（Ago）蛋白家族组装成RNA诱导的沉默复合物（RISC），利用siRNA的反义链与特定mRNA进行配对，并对mRNA进行降解，从而沉默特定基因的表达。RNAi高度保守，特异性较强，而且微量dsRNA即可引发明显的干扰作用，所以RNAi技术在反向遗传学、改良品种、植物保护等方面有广阔应用。关键词：RNAi技术；siRNA；基因沉默；植物；应用TechnologyofRNAianditsapplicationinplantLIAOShi-miao(CollegeofLifeScience,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing)Abstract:RNAinterferenceisamechanismofpost-transcriptionalgenesilencing(PTGS),whichistriggeredbydsRNAandtargetscertaingenes.ExogenousorendogenousdsRNAwillbecutbyRNaseⅢintosmallinterferingRNAswhosesequencesarequiteconservative.ThesesiRNAswouldcombineArgonautefamilyproteins,thusformtheRNA-inducedsilencingcomplexes(RISC).Astheeffector,RISCrecognizestargetmRNAswiththehelpofantisensestrandofsiRNA,thendegradesthem,throughwhich,certaingeneswillberepressed.RNAiishighlyconserved,anditworksspecifically.Besides,tracedsRNAcantriggersignificantinterferenceeffect.Accoddingtoallofthese,RNAitechnologyhasbroadapplicationinthereversegenetics,improvementofvarieties,protectionofplants,etc.Keywords:thetechnologyofRNAisiRNAgenesilencingplantapplication在基因工程中，常常出现目的基因表达量很低或不表达的情况，甚至出现体内同源基因表达也受到抑制的现象。1990年，Morgenstern研究组向矮牵牛中导入色素合成基因，而矮牵牛花瓣颜色并没有加深，反而变浅了。随后在针对线虫的基因表达抑制实验中，Fire等人发现，向线虫内注入dsRNA比ssRNA产生强烈得多的抑制效果，而该抑制过程发生在受抑制基因转录过程完成之后。此后，在多种其他模式生物中也陆续发现了RNA干扰现象。RNA干扰在生物界中的广泛存在及在机体防御、发育调控等生命活动中的重要作用昭示了其在揭示生命活动基本规律研究中的广阔空间和在性状改良、疾病治疗等基因工程中的巨大应用价值。2002年，《Science》杂志将RNA干扰的发现评为年度世界十大科学成就之首。1RNAi的作用机制在阐述RNAi的作用机制的模型中，多将RNAi的作用过程分为三个基本步骤[1]：siRNA的形成，RISC的形成以及siRNA的级联放大。1.1启始步骤dsRNA是RNAi过程的触发物，它可由外源注射、侵染病毒转录或转座子活动而产生。这些通常大于30bp的dsRNA可在Dicer的切割下形成19~25bp的siRNA，Dicer是RNaseⅢ酶的一种，含有解旋酶(helicase)活性以及dsRNA结合域和PAZ结构域[2]。siRNA为双链结构，5′端磷酸化，3′端有两个突出的碱基，通常为AA或UU。siRNA序列具有高度的保守性，尤其是序列中间的几个碱基，一个碱基的突变即可引起沉默效果的急剧下降。siRNA与靶mRNA的同源性是RNAi特异性沉默靶基因的基础。1.2效应阶段在RNAi的体外研究系统中，siRNA的沉默效果在一定程度上随着siRNA添加量的增多而加强，但当添加量超过一定区间后，沉默效果不再加强。经研究发现，还需要其他的因子与siRNA结合才能形成具有沉默效应的复合物——RNA诱导沉默复合物（RISC）。在这些因子中，研究较多是Argonaute（Ago）蛋白家族，其具有PAZ和PIWI两个特征性的结构域，尽管两者的功能不是十分清楚[3]。当RISC与靶mRNA接触时，siRNA解链，暴露的反义链与靶mRNA上的序列进行特异性结合，并在siRNA序列中间处开始降解靶mRNA，从而实现转录后沉默。1.3级联放大作用研究发现，微量的siRNA即可实现效果极佳的沉默，原因在于RNAi过程中存在信号放大效应。siRNA不仅参与RISC的形成，还能作为引物，以靶mRNA为模板，在RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-directedRNApolymerase，RdRp）作用下，合成dsRNA，而这些新合成的dsRNA又会被切割形成更多的siRNA。经过反复循环，RNAi的效果得到明显增强。2RNAi技术流程在RNAi现象发现以来，人们便不断尝试运用其原理发展出一套新的基因沉默技术，其中综合了生物信息学、生物化学、病毒学等多种学科知识。2.1siRNA序列的设计siRNA序列和靶mRNA序列的同源性是RNAi特异性沉默的必要条件。在设计siRNA时，应注意以下原则[4]：①选用mRNA中较为保守的长约20bp的序列，这对避免脱靶有重要影响；②避免mRNA上的调控序列，因为这些序列上结合的因子会与siRNA进行竞争；③真核生物的mRNA会经历内含子的剪辑，应避开内含子序列；④降低siRNA序列自身进行碱基配对而形成二级结构的可能；⑤依据经验，通常siRNA的G/C含量在40%～55%之间为佳。对于这些规则的权重较难确定，在设计siRNA时，应设计多套序列，以作候选。目前，已经开发出一些能对siRNA进行评分的软件，虽然其打分规则是建立在积对大量数据分析的基础上的，但设计的siRNA的使用效果还是由试验来说明。2.2siRNA的载体构建及导入细胞将siRNA导入细胞中可分为两种技术路线：先构建体外载体dsRNA再导入细胞，或构建体内载体合成siRNA。2.2.1dsRNA导入细胞在通过化学合成等方法合成dsRNA后，可运用常见的转基因方法将其导入受体细胞中。如将dsRNA附着在微粒上，以微粒轰击受体细胞；还可以在细胞悬液中施加电场，使其穿孔，从而导入dsRNA；对于易受外界环境刺激的胚胎细胞，可采用显微注射。总之，可根据受体细胞的特性、实验目的和实验条件来选用合适的方法。2.2.2体内载体合成siRNA此方法的实质是在普通质粒的基础上，构建与siRNA序列一致的DNA克隆位点。以siRNA序列为模板设计出一段反向重复的DNA序列，再将此段DNA序列插入到质粒的克隆位点上。在该质粒中，启动子必须是RNApolymeraseIII较易结合的[5]。最后运用基因工程的常规方法将重组质粒转入受体中。此外，还可以将构建好的克隆序列与减活病毒的基因组链接起来，通过病毒的侵染将其导入细胞中。该方法的优点在于由受体在胞内大量合成dsRNA，避免体外合成和提取dsRNA的繁琐步骤，而且转化效率高，沉默效应可随质粒或病毒的复制和分配而遗传。3RNAi在植物研究中的应用已有的研究表明，RNAi可有效地抑制入侵病毒和转座子的活动，在基因工程中，外源基因也经常被RNAi所沉默。而且RNAi已发现存在多种物种中，并在机体的生长发育调控中发挥重要作用。所以，人们猜想RNAi是机体的重要防御机制之一，还可能参与生物的进化过程。RNAi具有高度保守、反应迅速、沉默效果明显等优点，在植物体内，siRNA还可以通过导管、筛管和胞间连丝进行扩散。利用这些特点，可以对植物进行功能基因组学研究，或通过沉默特定基因的表达进行品种改良，还可以使植物获得对特定病毒的免疫能力。3.1植物基因功能组学研究随着DNA测序技术和生物信息学发展，人们可以很快地获知特定基因的序列，人类基因组计划的完成便是人类在结构基因组学方面的研究日渐成熟的标志。现在，研究者越来越注重对基因功能的探究和分析，功能基因组学的研究成果将赋予人类更多改良生物性状的手段。在进行反向遗传学研究过程中，可针对基因组设计多种siRNA，分别观察不同的siRNA沉默效果下的植物表型，即可构建多种siRNA序列所对应的植物表型库。由于siRNA通过降解靶mRNA实现基因表达沉默，所以并不影响基因组结构。3.2育种改良通过RNAi沉默特定基因的表达，调整植物的特定代谢途径，从而改良其性状。靶基因可以是一个基因，也可以是在功能上相关的一组基因。靶基因还可以是某类阻遏基因，通过沉默阻遏基因来间接调高受阻遏基因的表达。在实际应用方面，见诸报道的有利用RNAi技术沉默烟草中的脱甲基酶基因，从而降低烟草中致癌物——N亚硝基去甲烟碱（NNN）的含量；利用RNAi技术沉默水稻鲨烯合酶基因，提高水稻的抗旱能力[6]。3.3增强植物抗虫抗病毒能力在抗虫方面，先确定害虫体内对其代谢活动较为重要的基因，根据该基因序列设计出siRNA，将其导入植物体内，当害虫采食植物后，siRNA转移到昆虫体内，siRNA发挥沉默效应，干扰昆虫代谢活动，致其死亡。由于关于基因水平转移的研究不是十分清楚，siRNA能否转移到昆虫体内，并对其代谢进行干扰尚不清楚。在抗病毒方面，也是通过设计出与病毒基因具有同源性的siRNA，并将其导入植物体内而赋予植物免疫能力。而siRNA还可通过导管和胞间连丝进行扩散。4展望RNAi作为一种转录后沉默机制，具有广阔的研究前景和巨大的应用价值，已成为生命科学研究、作物性状改良、基因医疗等多方面的研究热点。然而，RNAi分子机制的研究并不是很清楚，Dicer是如何识别外源dsRNA的，RISC中包含了哪些因子，降解靶mRNA过程中，RISC是如何判定siRNA的哪一条链作为反义链的，siRNA在机体内的稳定性如何。这些问题的解决需要更深入的研究，而RNAi技术也将随之得到完善和更广泛的应用。参考文献：[1]TuschlT，BorkhardtA.SmallinterferingRNAs:Arevolutionarytoolfortheanalysisofgenefunctionandgenetherapy[J].MolecularInterventions，2003，2(3)158-167[2]齐飞，巩振辉，赵会芳.RNAi及其在植物研究中的应用[J].西北农林科技大学学报，2004，32：31-36[3]CeruttiL，MianN，BatemanA.Domainsingenesilencingandcelldifferentiationproteins:thenovelPAZdomainandredefinitionofthePiwidomain[J].TRENDSINBIOCHEMICALSCIENCES，2000，25（10）481-482[4]樊鹏程，贾正平，马骏.siRNA设计研究进展及在线设计[J].细胞与分子免疫学杂志，2008,24(2)：202-203[5]方华舟.核糖核酸干扰(RNAi)研究进展及其在植物学中的应用[J].内蒙古农业科技，2007，5:70-74[6]王婷婷，王丹丹，RahmanLaibiChelab.RNA干扰及其在植物研究中的应用[J].生物技术通报，2013,