RNA干涉的研究进展及应用前景

RNA干涉的研究进展及应用前景摘要：RNA干涉是广泛存在于生物体中的一种转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)，它是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)介导的同源mRNA高效特异性降解，从而导致基因表达沉默。从RNAi现象发现以来，进行了许多的研究，对其的基本作用机制有了初步的了解。作为一种阻断基因表达的新手段,RNAi技术日趋成熟完善,开辟了一条基因治疗的新途径。RNAi技术在很多人类疾病的基因治疗上都有应用，如肿瘤、癌症、病毒性感染疾病等方面。关键字：RNA干涉；基因沉默；机制；应用RNA干涉（RNAinterference,RNAi），是真核生物中普遍存在的一种自然现象，在生物体内双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发同源mRNA高效特异性降解，从而导致基因表达沉默。dsRNA可以抑制不同类型细胞的靶向基因表达,用特异性的抗体几乎检测不到靶向基因所表达的蛋白质。因此,RNA技术又被形象的称为基因敲除(knockout)或基因沉默(genesilencing),RNAi是一种典型的转录后基因调控方法,又称转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)[1]。它广泛存在于生物界，是生物体抵御病毒或其他外来核酸人侵而保持自身遗传稳定的保护性机制[2]。1.RNAi的发现历史九十年代初期,科学家在向牵牛花转导色素合成基因时,观察到“共抑制”(cosuppression)现象。Jorgensen等将产紫色素基因导入矮牵牛属植物中,希望花的紫色更深,却发现转基因后部分花的颜色不但没有加深,反而变成白色,这表明外源和内源产紫色素基因的表达都受到抑制,他们将这一现象称为共抑制(cosuppression)[3]。所谓共抑制是指内源基因在转基因或病毒感染的诱导下发生的基因沉默现象，大部分是转录后水平的基因沉默(PTGS)[4]。1994年，意大利的Cogoni[5]将类胡萝卜素合成所需基因转入到粗糙红色链胞酶中,结果导至30%的转化细胞中的霉菌自身基因失活，他们叫这种基因失活现象为压制（Quelling）。1995年，Guo[6]等发现注射正义RNA和反义RNA均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。直到1998年，Fire[7]等证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发，并将这一现象命名为RNAi。在后来的研究中，不断发现由dsRNA介导的RNAi现象出现在多种真核生物中，如真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等。2.RNAi的作用机制根据现有研究显示，可能的作用机制可分为三个阶段：起始阶段、效应阶段和循环放大阶段。效应阶段即当病毒基因、人工转入基因及转座子等外源性基因随机整合到真核宿主细胞基因组内,并利用宿主细胞进行转录时,常常产生一些与这些基因的mRNA同源的dsRNA。dsRNA在ATP供能的情况下，被Dicer酶切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约21～23bp)，即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链。效应阶段，反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。循环放大阶段是由siRNA引发的。siRNA作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。RNAi的作用机制决定了RNAi有以下几个特点：高序列特异性、高效性、RNAi抑制作用迅速、RNAi的靶基因位点具有选择性、具有高稳定性[8]、可传播性与遗传性、对ATP与时间计量的依赖性[2]。3.RNAi的应用在过去的20年，RNAi作为沉默基因表达的本能机制而出现，这古老的抗病毒反应可以用来特定地抑制某种目的基因的功能，RNAi正成为一个非常有效地研究中工具用于揭示许多基因的功能[9]。RNAi的生物功能遍布生物体的整个生命周期，包括：发育、代谢、对逆境的反应、疾病的抗性以及其他各个方面[10]。目前，与RNAi相关的研究主要集中在治疗人类疾病和提高植物的性状。3.1RNAi在肿瘤治疗中的应用肿瘤（Tumor）是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。学界一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。良性肿瘤在通过手术治疗后一般能够恢复健康，但是恶性肿瘤因为其顽固性不容易被治愈。恶性肿瘤也就是人们常说的癌症。而使用RNAi技术来治疗肿瘤在近年来是热门的研究方向，许多种癌症都已证实RNAi技术可以抑制肿瘤的体外和活体内的生长。如肝癌、宫颈癌、乳腺癌、鼻咽癌及胰腺癌等。肿瘤细胞中调节细胞增殖、凋亡、细胞周期和信号转导等的肿瘤相关基因都可作为肿瘤治疗药物的靶分子[11]。那么通过RNAi可以使肿瘤细胞这些相关基因表达沉默，从而达到治疗肿瘤的目的。很多实验证明，科研人员利用RNAi抑制癌细基因的表达，且在很多的肿瘤研究中取得了显著的效果。如Cmkovic-Mertns[12]等研究发现在宫颈癌细胞中，他们选用可产生凋亡作用的livin基因作为研究对象，用针对livin基因的siRNAs特异性高效地抑制肿瘤细胞中livin基因的表达，同时还发现针对livin的基因的siRNA能够有效增加livin阳性肿瘤癌细胞对诱导细胞凋亡的刺激因素的敏感性。在黄迪南[13]等的实验中，也得出了siRNA表达载体介导的RNAi能有效地抑制Hela细胞中hPOT1基因表达，从而导致Hela细胞凋亡。在其他研究人员的试验中，通过RNAi技术对其他一些基因表达地抑制来抑制Hale细胞的活性或者使其失活。对于其他癌症，也有相似的研究。如RNAi沉默chk1基因的表达，针对chk1的RNAi可以提高Lewis肺癌细胞的抑制率和凋亡[14]。在RNAi下调LAT1的表达对胃癌细胞SGC-7901的体外增殖、迁移与侵袭有抑制作用，并且细胞周期被阻断，LAT1在胃癌细胞恶性生物学行为中其关键作用，对其细胞增殖、迁移与侵袭中发挥重要作用[15]。对于肿瘤的治疗，关键在于肿瘤细胞的超强生命力，不断裂变增生。而且，肿瘤细胞会扩散，一旦扩散，则治疗会更加困难。现如今的治疗方法一般就是长期化疗，然后再进行手术。长期的化疗，会导致人体免疫力的降低，倘若体内还有残留或潜伏的肿瘤细胞，则很容易复发。RNAi技术可以从基因的水平上抑制肿瘤细胞某些基因的表达，从而导致肿瘤细胞分裂增殖或者转移被抑制，甚至可以导致肿瘤细胞的死亡。相较传统的治疗方法，RNAi技术更能从源头解决肿瘤治疗的问题，也不用通过手术切割身体的一部分。在未来的研究中，随着RNAi技术的完善，该项技术一定会在肿瘤的治疗中广泛应用。3.2RNAi在病毒性感染疾病中的应用病毒性感染疾病是一类传染性强、危害性大的疾病,目前的治疗主要依赖药物和干扰素。然而很多的病毒性疾病，仍然需要更加有效的治疗方法。如艾滋病（AcquiredImmuneDeficiencySyndrome，AIDS）、乙肝、丙肝、禽流感等。RNAi技术的发现以及对它的不断研究，可能为病毒性疾病的治疗提供更加有效的途径。RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制,越来越多的研究者利用此项技术针对病毒特定基因来抑制病毒的复制,或者利用siRNA作用于病毒靶受体或辅助因子以干扰病毒的侵染,以期达到治疗病毒性疾病的目的[16]。近年来,RNAi在ADIS、乙肝、甲肝等病毒性感染疾病中的应用研究活跃，并且取得了令人鼓舞的成绩。引起ADIS的病毒是感染人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus，HIV）。从发现到现在短短几十年时间内，随着HIV的广泛传播和流行，ADIS已成为危害人类的又一大疾病，而对它的治疗却一直没有行之有效的方法，大多数的抗HIV治疗药物不能对疾病进行彻底的治疗,而且患者还需要长期终身服药。RNIi技术则为ADIS的治疗带来了新的希望。其基本策略是选择HIV病毒或宿主细胞基因作为靶点,如在nef、tat基因及HIV21辅助分子的相应基因或是针对宿主的细胞表面受体,设计siRNAs针对CD4,CXCR4和CCR5来阻止病毒的入侵[17]。而有关研究对通过对NCBI发表的1000多个HIV-1序列做了同源比较，选择了HIV-1gag、env、nef基因中极保守的5个序列作为siRNA作用的靶序列，并利用H1启动子构建siRNA表达载体，在细胞内自主合成约19bp的5种siRNA样转录产物，均能不同程度地抑制HIV-1特异性目标基因的表达，其中针对gag1，env1，nef基因的3个siRNA抑制效果最明显[18]。NovinaCD等用化学合成法制备了针对宿主细胞CD4mRNA的siRNA。转染能表达人CD4抗原的Magi细胞，三天后通过Northern印记检测，发现CD4mRNA含量减少了8倍，相应的HIV-1感染量也减少了四倍[19]。张涛等[20]在HIV-1vif基因区中筛选获得一个具有高效抑制特性和较好保守性特征的siRNA序列,同时证明其具有vif基因抑制特异性,整合有该siRNA表达元件的HIV-1易感T细胞株可高效抑制HIV-1在细胞中的复制,具有良好的应用潜力。乙肝和丙肝是分别由乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)和丙型感炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)。众多实验结果表明，RNAi技术可以阻止HBV和HCV的复制。孙朝晖等[21]利用siRNA表达框架法设计针对HBVX基因的siRNA，转染HepG2.2.15细胞，转染后的HBVX基因mRNA的量明显减少，而且HBsAg和HbeAg的分泌也被抑制，抑制高峰在48h。结果显示，针对HBVX基因的siRNA在体外具有抑制HBV复制和抗原表达的作用。陈佳玉[22]选择HCVNS3基因片段作为靶序列，合成含有靶序列的DNA片段并克隆到pGCs-iU6/Neo/GFP/siNeGative载体中,构建可表达具有发夹结构双链siRNA的真核表达质粒pGCs-iU6/Neo/GFP/A,并转染Hela细胞,用HCV攻击该细胞，TCID50的测定显示细胞存活率实验组明显高于对照组，RT-PCR结果显示pGCs-iU6/Neo/GFP/A转染组的HCV负链RNA表达量显著低于对照组，说明重组质粒表达产物能成功地使模型细胞中的HCVNS3基因沉默。3.3RNAi在其他疾病中的应用RNAi技术在其他的疾病中也有着应用，例如：心血管疾病，神经系统疾病、内分泌系统疾病、遗传性疾病、视网膜疾病等。4.RNAi技术面临的问题及展望虽然很多研究显示RNAi技术为人类疾病的治疗带来了新的方向，但是在其临床应用中还存在未能解决的问题。例如，外源的dsRNA或者siRNA进入细胞需要一定的表达载体，而这些表达载体对人体是否具有副作用?再者，外源dsRNA的导入会敲除内源基因，也许会破坏天然的细胞防御系统。而对于病毒性感染疾病的治疗，因为病毒DNA具有高度变异性，而RANi具有高度的特异性，则会导致无法对靶基因实施有效的沉默或者效果减弱。这一系列问题的解决是RNAi技术能否应用到临床的重点。RNAi技术已经在全世界引起了广泛的重视，它的发现为分子生物学和细胞生物学