RNA提取和反转录

RNA提取实验方法1、准备工作：a、按照2.1.3.2收样方法，收取PH-1野生型分生孢子、菌丝（6h、12h、24h、36h）、9d子囊壳。b、200℃高温对研钵和研磨棒灭菌。c、电泳槽用3%的H2O2浸泡过夜后用去离子水洗净待用。d、用70%酒精将超净工作台和研磨样品所需的桌面擦洗干净。2、将样品倒入液氮预冷的研钵中，迅速研磨（3次），待将要液氮挥发完全时，将样品粉末倒入RNA专用离心管内。加入1mlTrizol，涡旋震荡至混合均匀。3、静置10min后，加入200μL氯仿上下翻转至混合均匀。4、4℃，1000rpm离心15min5、将上部澄清液转移到新的无菌的1.5ml离心管中，然后加入等体积与管内溶液的异戊醇。6、静置15min后，4℃离心机10000rpm，15min。7、倒去上清，加入1ml的75%乙醇。洗涤沉淀。8、7500rpm，4℃，离心5min，倒去上部澄清液，置于超净台中吹干。9、加入100-200μL的DEPC水溶解沉淀。10、溶解后取5μL稀释10倍测RNA浓度。11、电泳检测。DNA的消解1、在1.5ml离心管中配制以下反应体系：TotalRNA20μg10×DNaseIreactingbuffer10μLDNase（RQDNAse-free，DNase）30μLRNAfreewater至100μL2、37℃水浴30min。3、分别加入400μLDEPC水和500μL的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），混匀后4℃，1000rpm离心10min。4、将上部澄清液体转移至新的无菌的1.5ml离心管中，加入等体积于管内溶液的氯仿。上下翻转后4℃，1000rpm，10min。5、将上部澄清液体转移至新的1.5ml的离心管中，加入2倍体积于管内溶液的100%乙醇后，置于-20℃冰箱过夜沉淀。6、4℃，12000rpm，离心15min。7、倒去上清，75%乙醇洗涤沉淀。8、4℃，12000rpm，离心15min。9、倒去上清，100%乙醇洗涤沉淀。10、倒去上清，吹干后，加30μLDEPC水溶解。11、溶解后，取出2μL测OD。反转录1、PCR管中加入：模板RNA1μgPrimer：digo（dT）18primer1μLDEPC水至12μL2、混匀后，微离心，置于65℃，5min。3、将PCR管插于冰上冷却10min，4、加入：5×reactionbuffer4μL(20μ/μl)RibdockTMRNaseinhibitor1μL10mMdNTPmix2μL（200μ/μl）ReverseTranscriptase1μL5、混匀后，微离心，置于42℃，1h。6、70℃，5min终止反应。-20℃保存。1RNA提取和后处理2.1IsolationA.准备工作1.TRIZOL,Chloroform,Isopropylalcohol,75%Ethanol(inDEPC-treatedwater),DEPC-treatedwater2.2mltube(RNasefree),1.5mltube(RNasefree),PCRtube(RNasefree),cuttips(RNasefree)B.步骤1.HOMOGENIZATIONS1)Lysestissues(around0.1g)inliquidnitrogenandtransferitinto2mltube2)Add1mlTRIZOLassoonasnitrogenvaporizes3)Shaketubesvigorouslytomixwell4)IncubatethehomogenizedsamplesatRTfor5min2.PHASESEPARATION1)Add0.2mlofchloroformper1mlofTRIZOLReagent.2)Capsampletubessecurely,shaketubesvigorouslyfor15s3)Incubatethemfor2~3minat4℃4)Centrifugethesamplesatnomorethan12,000gfor15minat4℃5)Transfertheaqueousphase(upperphase)toafreshtube3.RNAPRECIPITATION1)PrecipitatetheRNAfromaqueousphasebymixingwith0.5mlofisopropylalcohol.2)Incubatesamplesfor10minat4℃3)Centrifugeatnomorethan12,000gfor10minat4℃4)Removethesupernatant4.RNAWASH1)WashtheRNApelletoncewith1mlof75%ethanol.2)Mixthesamplebyvortexingandcentrifugeatnomorethan7,500gfor5minat4℃3)BrieflydrytheRNApellet(air-dryfor5min~10min.ItisimportantnottolettheRNApelletdrycompletelyasthiswillgreatlydecreaseitssolubility.PartiallydissolvedRNAsampleshaveanA260/2801.6)5.REDISSOLVINGTHERNADissolveRNAin50ul~100ulofRNase-freewater(for10min)2.2Purification*事先要对提取样品的OD值进行检测1、用1.5的离心管配制下列反应体系，总体积100ul：TotalRNA70ul（20～50ug）10XDNaseIbuffer10ulDNaseI（5U/ul）4ulRNaseinhibitor(40U/ul)1ulDEPCtreatedwaterto100ul（a.最后加入DNase；b.不同公司的体系稍有差别，如Promega公司体系如下：TotalRNA30ug（15~20ug）10XDNaseIbuffer10ulDNaseI（1U/ul）30ulDEPCtreatedwaterto100ul）2、37℃反应30分钟。（消解DNA）3、加入10ulstopsolution，65℃水浴10min，消解完成4、稀释10倍后测OD，并电泳检测。纯RNAODA260/A280=2.0，结果在1.8-2.0的RNA较好可用；小于1.8蛋白污染；大于2.2，RNA降解。电泳时要快速防止RNA降解，200V电泳15分钟后EB染色5～8分钟后照相。较好的RNA28s：18s=2（染色结果应该有三条带：最远端有一条较模糊的带，是5sRNA和其他杂质成分，不影响提取的结果；另外两条带即28s和18sRNA，前者应较亮，如果反之，则说明28sRNA降解较多；如果这两条带较为模糊，则说明RNA在提取过程中降解，结构不完整，效果较差）5、因为Tap酶不能以RNA做模板，所以可用普通tap酶做PCR检测有无基因组DNA污染，如果能扩增出条带说明有DNA污染。P.S.如果提取RNA质量不好，完成第2步后，进行如下步骤3、加入400ul的DEPC处理水，混匀。4、加入500ul（1倍体积）的酚：氯仿：异戊醇（酸性），充分混匀30秒。5、12000rpm，4℃离心10分钟，去上层液转移到另外一个预冷的1.5ml的离心管中。6、加入等量氯仿混匀30s，4℃下12000rpm离心10min7、加入1倍体积的异丙醇沉淀过夜或者室温沉淀30分钟（沉淀最好能在2h以上）。（或加入2倍体积无水乙醇-20℃过夜（至少沉淀2h以上））8、12000rpm，4℃离心回收沉底，用75%的酒精洗涤沉淀。9、再用无水乙醇洗涤沉淀后，超净工作台吹干10分钟。10、用30ulDEPC水4℃溶解30-60分钟，或65℃促溶10分钟，-80℃保存。消解完成2.3ReverseTranscription冰上操作，PCR管、枪头均为RNAfree1.体系模板RNA1ugPrimer：oligo(dT)18Primer1ulDEPC水至12ul2.轻轻混匀，微离心，65℃温浴5min3.冰上降温10min后微离心4.加入下列组分5×reactionbuffer4ulRibolockRNaseinihibition（20u/ul）1ul10mMdNTPMIX2ulReverseTranscriptase(200u/ul)1ul5.混匀并微离，42℃温浴60min6.70℃5min终止反应，（终止后可加入180ulDEPC水稀释10倍），-20℃保存P.S.a．cDNA在定量前可用内参引物tublin检测，用水和其他cDNA做CKb．tublin引物信息：Tm=60℃~62℃；延伸72℃24s