RT-RCR和RACE的区别

无论是RT-RCR还是RACE技术，无非都是先利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因序列，其基本原理不外乎都是常规PCR技术的扩展。1、这两种方法有什么不同？首先是二者的“目的”不同：RT-RCR往往是为了扩增获得基因cDNA的“核心”片段，而RACE技术之所以称为(rapid-amplificationofcDNAends)快速扩增cDNA末端：是通过RT-RCR的手段进行cDNA未知片段（末端）快速克隆的技术。目的有两个：①根据已知序列RT-RCR产物获得未知cDNA序列；②获得已知cDNA的山下端，即末端全长；其次是二者“手段”的不同：RT-RCR一般使用上下游双特异性引物进行PCR扩增，而RACE技术一般使用锚定PCR的方法：即一侧为通用接头引物，另一侧为基因特异引物GSP进行PCR扩增（因单引物特异性的局限性，RACE的过程中往往需要进行巢式PCR）总结一下：除了模版的不同外，二者的关系类似于“常规PCR技术”和“基因组步移技术”的区别！2、RT-PCR和RACE各在什么情况下用？首先：RT-PCR往往是在未知基因片段的情况下使用，利用物种之间的保守性设计(特异性或兼并)引物，获得特定物种某未知基因的核心片段（常规RT-PCR很难一次性获得基因全长）；RACE技术一般是在RT-PCR的基础上，根据已有序列的进行的，已经有人（包括我们课题组）也曾尝试过一步法RACE（在未获得核心片段的情况下，利用单边兼并引物直接扩增未知cDNA序列的末端全长，但是成功率很低）；其次：RT-PCR主要是为了获得核心序列，因此RT-PCR可满足于物种之间序列比对，适时定量（REAL-TIME)等研究的需要；而RACE技术主要是为了获得基因全长，因此可满足全基因蛋白质推导，基因的蛋白表达等研究需要；另外补充一点：5'race存在着一定的局限。因为我们平时提RNA时，一般多少都有些降解，而RNA的降解是从5’端开始的，所以用5末端磷酸化的RTprimer去拉的时候，5末端往往不全，而且随着RNA链的增长，比如几K以上的，就更不能保证该prime能将5末端拉全。相对而言，3’race末端其实要好做很多，因为存在一个poly(A)，而且降解往往也不是从3末端开始的。所以一般情况下，这种方法也很常用，特别是在RT中。然而，也有局限性，如果你做的是细菌，那3末端就没有poly(A)，这个方法就不适用了，而且在有一些RNA中，这个poly(A)也很容易掉了。Takara的5'RACE和3'RACE的试剂盒的原理（见附图）。附：经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等,1995:Schaefer,l995:Chen,1998:Bespalova等,1998:Matz等11999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lockdockingprimer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3'端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16_30MN-3',M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5‘端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A);改进之三是采用RNaseH一莫洛尼氏鼠白血.病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h(60度-70度)有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR(hotstartPCR)技术和降落PCR(touchdownPCR)提高PCR反应的特异性。RACE引物的设计：基因特异性引物（GSPs）应该是：�23－28nt�50－70％GC�Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。必要时需进行巢式（二次）PCR;RACE技术（cDNA末端快速克隆技术）Time：2010-07-09PM21:30Author:bioerHits:1600timesRACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。RACE技术之主要分类一般分5-和3-RACE两种。3-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即可。大多实验者反映一次PCR可以搞定。5-RACE相对较难，目前流行几种5-RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环再PCR。还有，GENE公司一种smartRACEPCR，利用反转酶末端加C特点，直接加上多G接头，转换模板而无需用连接酶加接头。3-RACE、5-RACE更多内容详见RACE（rapidamplificationofcDNAends）技术的原理和操作5'-FullRACE的扩增原理图3'-FullRACE的扩增原理图RACE技术之引物设计基因特异性引物（GSPs）应该是：1、23~28nt2、Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果。需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2)。由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。3、cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。4、RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。5、在进行5’和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。6、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。7、引物GSP中的GC含量要在50~70%之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3’末端。8、如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSP1和GSP2之间至少是100~200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。9、降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。10、验证基因特异性引物的对照：单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。11、制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水。纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5~12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小。RACE技术之比较与优化RACE技术目的研究环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法3种常用5'RACE的技术的特点，并对它们进行了优化。方法以播娘蒿RNA为模板，先按文献标准方法进行5'RACE，然后通过增加反应时间，提高部分反应物浓度等方法进行优化。结果未优化前环化法和TdT酶法条带几乎不可见，SMART反转录酶法隐约可见条带，但不清晰。优化条件后，环化法出现弥散条带，TdT酶法胜之，但条带依旧弥散，而SMART反转录酶法最佳，获得清晰特异性条带。结论SMART5'RACE效果最好，其次为TdT酶法，环化法效果有待改进，同时通过优化条件可以明显增加产物的特异性，为实验研究中5'RACE方法的选择提供了依据。RACE技术RACE技术之实验步骤cDNA第一条链的合成：我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。注意：在水浴或酒精浴中保温会减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。直接进行第二链的合成。cDNA第二链的合成：第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。1、建议进行阳性对照，cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5~3kb之间。2、通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。3、按照程序进行连接反应。4、如果没有对比样品和对照的产量，利用Tricine-EDTAbuffer制备接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀释物，用两种稀释物进行RACEPCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。RACE技术之PCR扩增------5’和3’的RACE-PCR利用以下的程序进行降落PCR反应：94℃30s;[94℃5s,72℃4min];[94℃5s,70℃4min];[94℃5s,68℃4min]5cycles5cycles20~25cyclesPCR扩增注意：我们建议使用降落PCR反应，这就要求GSP的Tm值≥70度。1、当循环结束时，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl，使用适当的分子量marker。2、可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带，在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2~5kb的时候，经常使用4min，0.2~2kb的时候将延伸时间减到2~3min，对于5~10kb的条带，延伸时间增加到10min。RACE技术之产物验证1、应该对RACE的片段进行验证，以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。2、有3种验证RACE产物的方法：（1）比较由GSP和NGSP获得RACE产物。（2）Southernblot（3）克隆并测序3、建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。比较由GSP和NGSP获得RACE产物。4、对于5'末端的RACE产物，比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。5、对于3'末端的RACE产物，比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。6、如果条带是正确的，在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。RACE技术之克隆和测序1、可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，