基因检测技术在病原微生物检测及微生物质控中的应用

42ModernScientificInstruments20061基因检测技术在病原微生物检测及微生物质控中的应用苑红丽（北京恒信业科技有限公司北京100089）E-mail:[e-mail]摘要介绍食品、农产品中致病菌检测及细菌鉴定的主要方法。针对病原菌准确、快速分析的要求着重介绍了商品化的全自动PCR技术（BAXR系统）、全自动核糖体RNA基因指纹技术(RiboPrinterR系统)以及在食品安全、公共卫生、微生物质量控制等方面的应用。关键词基因检测技术;PCR;rRNA基因指纹;病原菌检测;细菌鉴定/分型/溯源中图分类号O65ApplicationofMolecularMethodsinDetectionofPathogensandMicrobialQualityControlYuanHongli(BeijingHighSceneTechnologyLtd.,Beijing100089,China)AbstractThemaintechnologiesusedindetectionofpathogensinfoodsandfarmproductsandidentificationofbacteriaaredescribed.Accordingtotherequirementsforaccurateandfastanalysisofpathogens,thecommercialautomatedPCRtechnology(BAXRsystem),automatedribotyping(RiboPrinterRsystem)andapplicationsinfoodsafety,publichealthandmicrobialqualitycontrolareespeciallyintroduced.KeywordsMolecularmethods;PCR;ribotyping;detectionofpathogens;bacterialidentification/typing/tracking1引言农产品和食品安全是一全球性问题。从不同危害因素在食物中毒中的频率得出结论，无论在发展中国家还是发达国家，生物性危害所占的比率均大于化学性等其他因素的危害。由此，病原微生物的检测凸现重要。2食品及环境样品中病原菌的检测方法对病原菌检测的要求:准确可靠地检出病原菌的存在,并排除假阳性的结果;快速提供检测结果,从而使快速应对成为可能:国际认可、标准化、可追踪。2.1培养法样品增菌后在选择性培养基上培养细菌菌落，对可疑菌落分离后作生化鉴定，优势：“金标准”-被广泛接受、被用作对照方法(e.g.FDA-BAM)、低成本；劣势：速度慢(需时2-9天）、对实验人员的操作水平有很高的要求。2.2免疫测定(ELISA,ELFA,免疫扩散测定)基于抗原-抗体反应。其优势:较快得到假定的结果（24-48小时内）;官方承认,广泛地被业界接受;可自动化;相应费用较低。劣势:交叉反应导致的假阳性率高、表型基础的检测技术、灵敏度为增菌后的106cfu/mL2.3PCR检测实现对特异基因片段的体外扩增和检测，其优势：检测目标菌的DNA、比培养方法快速（8-48小时）、比免疫测试方法灵敏；劣势：操作较繁锁、检测费用较高、存在实验室污染问题、未经验证认可。2.4BAXR病原菌检测系统全球第一台利用PCR检测病原菌的商品化仪器，并且得到国际权威机构的认可，已成为多个国家的官方方法，使PCR成为微生物检测的常规方法。自2000年11月上市，销售到30个国家400余台。该仪器的优点是:专一性和包容性极强的引物设计;简化操作过程,最少的手工操作;直接阅读（阴或阳性）检测结果;专利的PCR片状试剂及闭盖系统将污染降至最低。2.4.1BAXR系统的检测项目沙门氏菌Salmonella;李斯特菌Listeria;单增李斯特菌L.monocytogenes;大肠杆菌O157:H7E.coliO157:收稿日期：2005-08-17作者简介：苑红丽，高级工程师，从事基因工程研究多年，近年来致力于微生物检验技术与快速方法的推广。现代科学仪器2006143H7;坂崎肠杆菌E.sakazakii;空肠/大肠弯曲杆菌C.jejuni/coli;酵母和霉菌Yeast&Mold。2.4.2简单的四步过程①样品增菌②制备DNA扩增③DNA扩增④DNA检测2.4.3BAXR系统已经得到全球各独立机构，法规部门和食品企业的验证、认可AOACInternationalOfficialMethodSalmonella#2003.09;L.Monocytogenes#2003.12AOAC-RIPerformanceTestedMethodSalmonella#100201;Listeriamonocytogenes#070202;E.ColiO157:H7#010401;ListeriaUSDA-FSISAdoptionSalmonella#MLG4C.00;Listeriamonocytogenes#MLG8A.00FDAApprovalSalmonella;ListeriamonocytogenesHealthCanadaCertificationSalmonella#MFLP-29;Listeriamonocytogenes#MFLP-28E.coliO157:H7#MFLP-30;Enterobactersakazakii#MFLP-27AFNORCertificationSalmonella#QUA18/3-11/02NordValCertificationSalmonella#2003-20-5408BrazilMAPAOfficialReferenceMethodSalmonella#41JapaneseMinistryofHealth,LabourandWelfareListeria;Listeriamonocytogenes2.4.4BAXR系统的主要优势准确性:特异性:≥98%;灵敏性:1cfu/25g;有复验性的结果。快速:缩短增菌时间,当天或第二天结果。高通量。3细菌鉴定、分型及溯源的方法3.1表型检测方法被国际上用作金标准并作为对照方法的手工生化鉴定法,例如FDA的BAM;以及许多实验室使用的自动化、半自动化的鉴定系统,基于细菌对糖的代谢,例如API、ATBVITEK系统;或多种碳源代谢,例如BIOLOG系统;或脂肪酸组分分析,例如MIDISherlock系统等多种方法。传统的细菌分离、培养及生化反应等手工或自动的表型鉴定技术，已远远不能满足对各种病原微生物的诊断、流行病学的研究以及食品、制药等企业对微生物质量控制的要求，存在多种局限性：需要较多的人力;需要做多种辅助实验，如革兰氏染色等;很难区分到种以下；没有能力溯源,无法做出基于基因基础的快速、准确的决定，实验结果往往是不可靠的和不可重复的；苛生菌往往不能被有效地鉴定，需要重复试验，易产生主观臆断性；不适于区域/领域/全国性的网络建设。表型方法的优势是使用成本较低,半自动、自动化鉴定系统鉴定多数常见临床细菌到属/种的准确性亦较高。3.2基因型检测方法随着分子生物学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对他的外部形态结构及生理生化特性等一般检验上,而是从分子生物学水平上研究生物大分子,特别是核酸结构及其组成成分。在此基础上建立的众多技术中,PFGE(脉冲凝胶电泳)、RFLP(限制性酶切片断多态性)、ChipTechnology(芯片技术)、16SSEQUENCING(16S基因测序)Ribotyping(rRNA基因指纹技术)依据其不同的性能特点及实验室的具体情况等因素，业已逐步应用于细菌检验。3.2.1脉冲场凝胶电泳PulsedFieldGelElectrophoresis(PFGE)优势：高辨别力，用于菌株同源性研究。缺点：实验结果重复性差；需要很高的操作技术；耗工耗时（3-5天）；没有鉴定细菌的功能。3.2.2限制性酶切片断多态性RestrictedFragmentLengthPolymorphism(RFLP)优势：比PFGE省时,用于菌株同源性研究。缺点：非标准化,非自动化,比PFGE的识别力差;需要操作人员具备高水平的操作技术;没有鉴定细菌的功能。3.2.3芯片技术ChipTechnology优势:可以揭示大量信息;具备自动化的优势;快速。缺点:非常昂贵;非标准化;还未能应用于食品安全和公共卫生领域,目前主要在科研、新药研究等领域使用。3.2.416S基因测序16SSEQUENCING优势:具备属、种的鉴定功能。44ModernScientificInstruments20061缺点:难于区分亲缘关系很近的菌种;不能进行种水平以下的分型、溯源;样品制备时间为一天,分析需时3-5天;对操作人员有较高的要求,人为因素会影响鉴定结果。3.2.5全自动rRNA基因指纹(核糖体分型)技术AutomatedRibotyping1965年国际上开始研究生物体间核糖体RNA基因序列的关系,1983年美国杜邦公司JohnWebster申请欧洲专利:用基因指纹表现微生物的特色,1995年,杜邦Qualicon建立了全自动的rRNA基因指纹(核糖体分型)技术,开发出自动化的设备即RiboPrinterR系统,通过全自动地产生、分析rRNA基因指纹对细菌进行快速鉴定、分型，以表现出不同菌株的分子特征。微生物基因指纹自动产生过程①细胞裂解和限制性内切酶消化而产生特定的DNA片断②根据分子量大小进行电泳分离并转移到膜上③探针(E.colirRNA基因)杂交,化学发光底物与特殊片断结合④用数码相机检测并捕获片段的影像,数字化的影像被计算机自动存储,专用软件分析生成RiboPrintr模式。RiboPrinterR系统的特点只有RiboPrinterR系统提供/具有鉴定、分型和特性化菌株的功能。该系统具有以下特点：*准确(基因基础上的检测)；*快速(15-30分钟制备样品，之后上机8小时得到结果);*自动化的系统,易于使用;*强大的数据库、已存储超过6400种基因指纹图谱，207属，1500种及血清型;*标准化、可重复性的、一致的结果;*数字网络的能力、电子数据共享。全自动Ribotyping技术在食品安全、公共卫生、微生物质量控制等方面的应用①准确、快速地鉴定细菌。对一些细菌、直接鉴定出血清型，分辨出同种不同的菌株。以鉴定沙门氏菌为例，数据库中现有650余株基因指纹模式，代表260个血清型；单增李斯特菌的指纹模式多达45种......单增李斯特菌Listeriamonocytogenes②区分致病型与非致病型。例如VTEC（产生Vero-细胞毒素的大肠杆菌）的鉴定。37株VTEC菌株，16株非VTEC菌株。所有VTECO157菌株都得到正确的鉴定，没有非VTECO157菌株被鉴定为VTEC菌株。③追踪产品污染源例如：epidermidis(员工手)epidermidis(原材料)和epidermidis(终产品)④分子流行病学⑤食源性疾病、公共卫生、抗生素抗性、食品/药品QA/QC等检测监控网络建设的首选方法。⑥环境、生物防治的应用参考文献[1]JamesBruce,Automatedsystemrapidlyidentifiesandcharacterizesmi-croorganismsinfood.FoodTechnology,Jan1996,77-81[2]J.Bruce,E.M.Cole,AutomatedRibotyping,aStandardizedMethodformonitoringCurrentandEmergingofPopulationsofE.coli,2ndMeetingofSpanishMolecularMicrobiologistsValencia,SpainJuly21,1998[3]L.C.Bueno,L.Ferrantelli,Molecular