SOD_CAT及POD活性的测定

测定方法一．SOD，CAT及POD活性的测定分别取0.4ｇ材料于预冷的研钵中，加入8ml预冷的50mmol-1磷酸缓冲液（pH7.8）（先加2ml,在冰浴下研磨成匀浆后，将匀浆转入10ml离心管，再用6ml冲洗），10000rpm离心15min，取上清液定容至10ml后于4℃保存。上清液用于可溶性蛋白质含量、SOD活性及POD活性的测定。SOD活性测定1.显色反应取5mL指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按表47–1加入各溶液。混匀后，给1支对照管照上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，使酶活性高低适当调整反应时间)。当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表47–1中各试剂(酶液和核黄素除外)按比例混合后一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变。表47-1各溶液显色反应用量试剂酶）用量(mL)终浓度(比色时)0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750μmol/LNBT溶液0.375μmol/L100μmol/LEDTA-Na2液0.310μmol/L20μmol/L核黄素0.32.0μmol/L酶液0.12支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.5总体积3.33.SOD活性测定至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。以遮光的对照管作为空白，分别在560nm下测定各管的OD值，计算SOD活性。3.结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性[u/g(FW)]=式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。ACK——照光对照管的吸光度。AE——样品管的吸光度。VT——样品液总体积，mL。V1——测定时样品用量，mL。W——样品鲜重，g。蛋白质含量单位为mg/g。愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性1.取两支试管，洗涤后甩干水分。试剂管号（对照）测定管0.05mol/LPH5.5的磷酸缓冲液2.9ml2.9ml2%双氧水溶液0ml1.0ml0.05mol/L愈创木酚溶液1.0ml1.0ml蒸馏水3.0ml2.0ml总体积7.0ml7.0ml将上述各管立即放入预先调好37℃的水浴锅中保温5min以上（酶促反应），向对照管中加入0.1ml酶液，混匀，在λ470nm处调零，再向测定管中加入0.1ml酶液，并且立即计时，混匀后进行比色测定，3分钟时立即读取吸光度。（也可以每分钟读取一次，3分钟内吸光度变化值ΔA）2.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min·g（鲜重）]表示之。也可以用每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（u）表示。按下式计算酶的相对活性△A470×酶提取液总量（ml）酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）=———————————————————样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与用具】紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；【试剂】0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/LH2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。【方法】1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。表40-2紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管号S1S2S3粗酶液(ml)0.20.20.2pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5蒸馏水(ml)1.01.01.025℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。3.结果计算：以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FWtV.VAT124010式中A240=AS0－()AASS122AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1,AS2—样品管吸光值；Vt—粗酶提取液总体积（ml）；V1—测定用粗酶液体积（ml）；FW—样品鲜重（g）；0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。【注意事项】凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。