WB注意事项及常见问题

WB注意事项及常见问题注意事项一、样本收集1.组织样本原则上要求客户或我们的技术员把组织分切剪碎至研磨管（根据实验的需要告知他们取多少组织），并加入适量裂解液和研磨珠，然后放置于-80℃保存。具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”；2.细胞样品原则上要求客户或我们的技术员不要用胰酶把细胞消化下来，特别是分选对象是膜蛋白时，具体详情参照“细胞样品收集注意事项.doc”；二、总蛋白提取1.组织样品具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂；2.细胞样品具体详情参照“细胞样品收集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂；三、蛋白样本保存裂解细胞或组织提取总蛋白时，细胞碎片沉淀一般-20℃保存以防万一，提取好的蛋白样品分装2份，一份加入上样缓冲液变性后-20℃保存，一份直接-20℃保存；四、蛋白变性提取好的总蛋白取一部分（不是全部）加入上样缓冲液进行加热变性（100℃，5min），变性好的蛋白应该-20℃保存，冻融后不再需要加热变性；五、SDS-PAGE1.浓缩胶的胶浓度一般为5%，用于压沉样品；2.分离胶的胶浓度取决于分析对象的分子量大小，详情见WesternBlotting全攻略.pdf第4页；3.分离胶和浓缩胶的高度比为8:3；4.电泳结束后，应及时用清洗干净玻璃板，清洗时应使用海绵擦布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板；5.电泳结束后，应及时冲洗电泳槽，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀；6.清洗电泳芯时，一定要注意别弄段电泳丝；六、转膜1.注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的叠放位置，以保证正确的转印方向；2.注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的相对大小，以免造成短路；3.转印结束后，应及时取出转印膜，并立即用TBST漂洗1-2遍，并立即加入封闭液，这样可以避免膜上的杂质残留或膜变干导致背景高的问题；4.转印结束后，应及时冲洗转印槽和转印芯，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀；5.转印结束后，应及时用水泡洗海绵垫和滤纸，以免盐离子沉积，导致转膜时短路，并放在篮子上晾干，如果海绵垫和滤纸不及时晾干，容易导致海绵垫和滤纸内部的结构破坏；七、封闭1.进行封闭时，应加入足量的封闭液（以完全覆盖膜为底限），并保证整个封闭过程中，膜与封闭液充分接触，避免长时间离开封闭液，特别进行4℃静止封闭过夜时，一定要加入足量的封闭液和保证平坦放置；上述注意事项主要为了避免膜变干，导致背景升高；八、一抗杂交1.一抗的稀释比例：第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例，并根据实际的实验结果进行调整；2.杂交条件：如果是室温孵育，至少保证孵育1-2小时，并放置脱色摇床上进行摇晃，如果是4℃孵育，应孵育过夜，可静止亦可放置脱色摇床上进行摇晃；3.应使用专用的一抗稀释液进行稀释，使用后进行回收并4℃保存，如果回收的稀释抗体用沉淀或长菌，应丢弃；九、一抗杂交后洗膜1.一般使用标准的TBST缓冲液，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把NaCl的浓度提高到500nM(标准的为150nM);2.一般洗涤3次，每次10min，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把洗涤次数提高到4-6次；十、二抗杂交1.二抗的稀释比例：第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例，并根据实际的实验结果进行调整；2.杂交条件：一般室温孵育，孵育1小时即可（时间延长会产生非特异杂交，从而导致背景过高），并放置脱色摇床上进行摇晃（一定要避免膜变干，否则背景其高）；3.应使用封闭液进行稀释，使用后进行不回收；十一、二抗杂交后洗膜1.一般使用标准的TBST缓冲液，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把NaCl的浓度提高到500nM(标准的为150nM);2.一般洗涤3次，每次10min，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把洗涤次数提高到4-6次；十二、拍照1.注意选择曝光时间，同时兼顾工作效率，因选择连续拍照模式，这样总有一个何时曝光时间；十三、报告单整理1.原始图片；2.对比度和亮度调整的图片；3.图片说明：上样顺序；4.灰度值：原始值，数据标准化（同一个样品的目标蛋白的灰度值除以内参蛋白的灰度值），相对表达量（实验样品的数据标准化比值除以参照样品（问客户）的数据标准化比值），参照样品的相对表达量一定为1；5.实验方法：准确的一抗，二抗，稀释比例；常见问题一、没信号1.膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品也无条带：实验失败？抗体失效？；重新进行实验，重新稀释抗体；2.膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品有条带：实验样品降解？实验样品无该蛋白的表达？转膜效率过低？；重新进行实验，复核查找上述原因，以寻找对策；二、背景过高1.目的条带以外的区域有信号，如果是片状，甚至整块膜，一般是封闭不好，膜变干，一抗非特异杂交或二抗的非特异杂交导致；如果是条纹状，一般是由于膜上有压痕导致，如果是点状，一般是膜上有杂质，或泡膜时膜没有充分浸泡；三、杂带1.目的带以外的信号条带为杂带，一般由于一抗的特异性不好所导致，如果目的带比杂带信号强，可通过减低一抗的稀释比例，并缩短杂交时间解决；如果目的带比杂带信号弱，在不减低一抗的稀释比例的前提下，缩短杂交时间；并提高TBST缓冲液的NaCl的浓度提高到500nM；2.杂带如果与目的带的位置相距较远，可以不优化实验，直接裁剪即可，杂带如果与目的带的位置相距较进，应调整胶浓度，并延长电泳时间，已经采取上述解决方法；四、目的带弱1.一抗效价低：提高一抗稀释比例，提高杂交时间，减少洗膜次数，提高曝光时间，提高上样量；2.转膜效率低：检测转膜试剂和耗材，优化转膜条件；五、复合问题上述问题往往同时出现，首先客观冷静分析问题所在，针对问题采取相应策略，有些策略可能互相矛盾，应以解决主要问题为主；