实验四_水中细菌总数的测定和土壤微生物的分离[1]

实验三水中细菌总数的测定和土壤微生物的分离一实验目的1.学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法；2.了解水源水的平板菌落计数的原则。（一）水中细菌总数的测定二.实验原理：本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用肉膏蛋白胨琼脂培养基。本实验以普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，采用平板菌落计数技术来分别测定自来水和河水中的细菌总数。1-7组河水，8-10组自来水三、实验操作1.水体取样：应取距水面10～15cm的深层水样。先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水立即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。2.自来水取样：打开自来水龙头，让水流流出1min左右，用烧杯接取自来水。3.将河水水样分别稀释成10-1、10-2、10-3三个连续稀释浓度（注意：在稀释前后一定要充分混匀）、自来水样不稀释。注意：河水样的稀释，取1个灭菌空试管，加入9mL灭菌水。用取过灭菌水的移液管取1mL河水样，放入试管中，振荡试管混合均匀。4.涂布平板法：1）加热已经配制好的固体培养基（肉膏蛋白胨琼脂培养基），使固体培养基溶化。2）倒制平板：每个空平皿中倒约20mL的培养基，放置桌面待其凝固。3）用移液管吸取0.1mL水样，滴于平板中；将玻璃涂布棒于酒精灯的外焰上加热，杀死表面微生物，然后耐心待其冷却，然后用涂布棒将水滴均匀的涂满整个平板表面，尽量将水涂干。5.倒置于37℃培养箱中培养24h。6.菌落计数：1）挑取无片状菌苔生长的平板作为计数平板，若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布很均匀时，可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数。2）选择平均菌落数在30～300之间的平板来计算该水样的菌落总数。如果所有的平板的菌落总数都不在30—300范围之内，则取最靠近30—300的平板进行计数3）如果有两个稀释浓度的总菌落数落在了30—300范围之内，则先计算两个浓度下每ml水体中细菌总数，如果两个数值的比值大于2则取小的浓度，如若小于2则取两值的平均值。（二）土壤微生物的分离、培养一、实验目的掌握微生物分离纯化的基本操作技术二、实验原理从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用平板分离法：包括两个方面：1、选取适当的培养基2、挑取单菌落三、实验操作1、倒平板将营养琼脂培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基，加热溶化，待冷至55-60℃时，马丁培养基中加链霉素（终浓度为30µg/ml），混匀后倒平板。2、制备土壤稀释液称取土壤10g，放入盛有90ml无菌水中，剧烈震荡20min，充分混合。用无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入9ml无菌水中，混匀，以此类推，制备成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释度的土壤溶液。3、涂平板将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4，10-5，10-6种稀释度，再用无菌吸管分别吸取10-4，10-5，10-6种稀释度的土壤稀释液0.1ml，用无菌涂布棒涂布均匀后，静置5-10min。（若平板数量不足，减少10-6稀释度的平板）4、培养将高氏1号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃恒温培养箱中培养3-5d，营养琼脂培养基平板倒置于37℃恒温培养箱中培养2-3d。5、菌落形态观察、（计数）6、染色鉴定可疑菌落（细菌、放线菌、霉菌）（下次实验作）思考题：为什么马丁培养基中要加入链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？