DNA重组大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

1DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化DNA重组DNA重组（基因重组）是指，由不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。原核生物的基因重组有转化、转导和接合等方式。受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象，称为转化。通过噬菌体媒介，将供体细胞DNA片段带进受体细胞中，使后者获得前者的部分遗传性状的现象，称为转导。自然界中转导现象较普遍，可能是低等生物进化过程中产生新的基因组合的一种基本方式。高等动植物中的基因重组通常在有性生殖过程中进行，即在性细胞成熟时发生减数分裂时同源染色体的部分遗传物质可实现交换，导致基因重组。基因重组是杂交育种的生物学基础，对生物圈的繁荣昌盛起重要作用，也是基因工程中的关键性内容。基因工程的特点是基因体外重组，即在离体条件下对DNA分子切割并将其与载体DNA分子连接，得到重组DNA，并将其导入到受体中（微生物或高等动植物），从而使受体获得某些有益性状。1977年美国科学家首次用重组的人生长激素释放抑制因子基因生产人生长激素释放抑制因子获得成功。此后，运用基因重组技术生产医药上重要的药物以及在农牧业育种等领域中取得了很多成果。2质粒把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。YAC、BAC、噬菌体、细菌质粒等是重组DNA技术中常用的载体。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部3分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段（＜10kb）且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。本实验中应用T载体转化受体菌E.coliDH5α的菌株。由于T载体上带有Ampr和lacZ基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。因T载体带有Ampr（氨苄青霉素耐受）基因,故转化受体菌后只有带有T载体DNA的转化子才能在含有Amp（氨苄青霉素）的LB平板上存活下来;而未获得转化的空细菌则不能存活。此为初步的抗性筛选。T载体上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E.coliDH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,T载体和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在T载体和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-4半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到T载体质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去α-互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在LB培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解LB培养基中的X-gal，产生蓝色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的X-gal，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。注：X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）以半乳糖苷酶（b-galactosidase）水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside），为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。连接策略外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：（1）带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理质粒和外源片段，即可得到这样5的末端。但是在连接反应中值得注意的是，由于质粒和外源片段本身可能含有两个相同粘性末端，因此均可能发生质粒的自身环化或外源片段形成的寡聚物,而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须在实验方案中尽可能保证正确连接产物的数量达到最高，同时需进行后续阳性克隆的筛选。（2）带有非互补粘性末端用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。（3）带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于在连接反应中，平端的连接效率比粘性末端要低得多，故使用T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配,也可以有控制的使用E.coliDNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,6使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。转化转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：（1）细胞生长状态和密度:7不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或不足均会影响转化效率。（2）质粒的质量和浓度:转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA量过多或体积过大时,转化效率就会降低。一般情况下，1ng的DNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和，同时DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。（3）试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。（4）防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿、离心管等需经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌或过滤除菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染。本实验方案本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态（本实验购买了商品化的感受态）,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入8pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。带有插入片段的转化子由于破坏了半乳糖苷酶基因,呈白色;不带外源片段的转化子可以分解X-gal，呈兰色。将白色转化子挑出后扩大培养，PCR鉴定后进一步酶切鉴定。一、试剂材料及设备试剂：X-gal储液(20mg/ml)，IPTG储液(200mg/ml)，LB液体培养基，0.1mol/L的CaCl2溶液，Amp母液，含Amp的LB固体培养基，含X-gal和IPTG的筛选培养基，pMD18-Tvector；注：具体配方见实验六后附录材料：外源DNA片段:——PCR纯化回收产物，载体DNA——pBS质粒(Ampr,lacZ)，E.coliDH5α菌株——Rˉ,Mˉ,Ampˉ；设备：恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪，无菌工作台，微量移液枪，eppendorf管，低温冰箱,制冰机,分光光度计二、实验步骤及注意事项（一）连接反应1、样品混匀冰上溶解solutionI、vector及重组DNA片段等，涡旋混匀并短暂离心。92、配制连接体系按下列顺序在加入各种成分,建立连接反应。成分体积vector0.5μl纯化产物4.5μlTotal5μl注：纯化产物的使用量——0.1pmol-0.3pmol；3、加入SolutionISolutionI的体积为5μl，轻轻吹吸混匀。4、连接反应16℃连接30min（水浴或PCR仪进行）。（二）感受态细胞的制备(CaCl2法)1、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落,接种于5mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右（过夜）,直至对数生长后期；将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于50mlLB液体培养基中,37℃300转振荡培养3小时至OD600＝0.5左右。2、收集菌体将5ml培养液转入预冷的离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下4000转离心10分钟。3、CaCl2悬浮细胞，制备感受态10弃上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液1ml轻轻悬浮细胞,4℃下4000r/min离心10分钟。弃去上清,倒出培养液，将管倒置几秒钟以使最后残留的痕量培养液流尽。加入0.2ml预冷0.1mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,转入1.5ml离心管，冰上放置20分钟,即成感受态细胞悬液。4、感受态细胞冻存3中用含15%甘油的0.1mol/L的