HCV抗体检测介绍.

Anti-HCV检测的挑战和应对丙型肝炎—面临的挑战全球性的公共卫生的问题–肝脏疾病的最重要的原因–全球性流行性疾病不确定的传播方式–输血，不洁注射，母婴传播，医源性感染，性传播等–30%感染者感染途径不明“隐匿”的杀手–50-90%感染者无症状–30%感染者ALT正常–通常在筛查中发现进行性疾病–55-85%的感染者会发展为慢性感染HCV病毒学特征黄病毒属1有衣壳蛋白包裹2已知6种基因型，80个亚型3病毒基因组具有高度变异性3–形成不同基因构成的病毒亚群或准种1,4增殖速度：1012个/天21.PurcellR.NIHConsensusConferenceonHepatitisC.1997;2.NeumannA,etal.Science1998;282:103;3.LauerG&WalkerB.NEnglJMed2001;345:41;4.HoofnagleJ.NIHConsensusConferenceonHepatitisC.1997衣壳RNA基因组病毒颗粒核心蛋白中国丙肝临床报告病例逐年递增中国卫生部公告.庄辉.2012世界肝炎日全国丙肝专题会议.2114539380529277068192378108446131849153039173872020000400006000080000100000120000140000160000180000200320042005200620072008200920102011中国目前约有1000万例丙肝感染者临床报告病例仅是总体患者的冰山一角中国目前约有1000万例HCV感染者中国卫生部公告.庄辉.2012世界肝炎日全国丙肝专题会议.超过90%的HCV感染者尚未被发现历年报告临床病例总和100万例HCV特征决定准确的检测是疾病管理最重要防线病毒基因组具有高度变异性–目前尚无预防性疫苗HCV在体外持久的稳定性–丙肝患者体液污染的器械具有很强的传染性对于Anti-HCV筛查阳性者应及早确诊、规范治疗HCV感染诊断实验的选择方法筛查确诊疗程疗效的评估持久性应答预测ALT※Anti-HCV※RIBA※HCVRNA※※※※HCV基因分型※Anti-HCV是HCV感染筛查的指标80%急性感染进展为慢性感染Anti-HCV的漏检和假阳性是困扰实验室问题之一Anti-HCV确认阳性*+-Anti-HCV+9999(TP)9900(FP)PPV=9999/(9999+9900)=50.25%-1(FN)980100(TN)NPV=989,010/(1+989,010)=99.9999%感染者10,000未感染990,000灵敏度=99.99%特异性=99%prevalence=1%在低感染人群，假阳性不可忽略1%的感染率，如特异性99%，PPV只有50%抗-HCV筛查检测报告阴性或根据S/Co比值判定为阳性所有阳性结果高S/Co比值阳性*报告低S/Co比值阳性*RIBAHCV检测或阳性报告阴性报告不确定报告阳性阴性RIBAHCV检测HCVRNA的NAT检测阳性报告阴性报告不确定报告报告美国CDCAnti-HCV实验室检测结果报告导则11，MiriamJ.Alteretal-GuidelinesforLaboratoryTestingandResultReportingofAntibodytoHepatitisCVirusRIBA（以Chiron为例）两个以上条带（＞1+）为阳性Anti-HCV检测灵敏度也是不能忽略==窗口期==（70天）DNA阳性3rdgen1stgen2ndgen不同的3rd试剂第三代试剂之间也有明显差异2006Hep/RetroSymposiumIIIWashingtonD.C.,24-26September2006Anti-HCV有反应性进一步结果解释Anti-HCV有反应性–RIBA（+）Anti-HCV有反应性–HCVRNA（+）Anti-HCV确认阳性Anti-HCV确认阴性CDC，GuidelinesforLaboratoryTestingandResultReportingofAntibodytoHepatitisCVirus2003Anti-HCV有反应性RIBA（-）；Anti-HCV有反应性HCVRNA(-）/RIBA（-）HCVRNA（-）/RIBAIND视为低风险Anti-HCV有反应性进一步结果解释HCV有反应性–RNA(-)仍需要进行RIBA确认，尤其是低流行区域根据流行率的确认流程–流行率10%•先RIBA，后RNA最经济–流行率20%•先RNA，后RIBA最经济–流行率10-25%•两者方案，费用相当CDC，GuidelinesforLaboratoryTestingandResultReportingofAntibodytoHepatitisCVirus2003临床需要高性能的检测试剂假阳性不必要的补充确认检测不必要的就诊和心理伤害医疗纠纷假阴性传播扩散风险医疗安全风险延误病情CE1E2NS2NS3NS4NS5ANS5B5´UTR结构蛋白非结构蛋白3´UTRa)b)对于HCV病毒认知的深入使检测试剂性能逐渐提高聚合酶抑制剂NS5A抑制剂蛋白酶抑制剂新药物诊断试剂Core蛋白和NS3蛋白的免疫原性最强，是抗体检测最重要组份；第三代Anti-HCV检测试剂精选抗原靶位，提升检测性能NS3/Core抗体出现最早–NS3抗原在早期诊断和提高灵敏度上都均有重要价值，提高NS3抗原的配比–Core抗原中的N端保守区域易产生交叉反应，适度减少Core抗原的配比–随着重组技术的进展，使原料抗原的活性更强各种抗原的配比调整第三代Anti-HCV的平均窗口期是6-8周；NS3和Core抗体要早于NS4和NS5抗体数周时间第三代试剂中加入Core，NS3，NS4（部分厂家加入NS5)抗原。影响试剂性能的主要因素各种抗原的配比平衡增加NS3抗原，同时减少核心区抗原益处：–提升灵敏度–减少了非特异性反应挑战：–“度”的把握–掌握不好，容易漏检抗原的选择和生产工艺HCV病毒缺乏有效体外培养系统，难以从病毒中分离出天然抗原；生产的抗原材料与天然抗原的接近度越高，试剂性能越好。NS3是构像依赖性抗原，需要使用重组抗原–不同批次间抗原的均一性非常重要；NS4/Core抗原通常使用合成多肽抗原；了解试剂性能，是放心应用的前提！Elecsys®Anti-HCVII双抗原夹心法，18分钟Elecsys®Anti-HCVII全面升级viral(+)RNAgenomeviralpolyproteinCE1E2NS1NS2NS3NS4ANS4BNS5ANS5Bstructuralproteinsnon-structuralproteins合成肽合成肽重组抗原新设计的NS3抗原提升检测灵敏度和特异性新的试剂缓冲液减少干扰增强试剂的稳定性•应用Core，NS3，NS4抗原片段•不再应用NS5（对于灵敏度提升有限但是会降低检测特异性）Elecsys®Anti-HCVII多中心评估评估单位评估内容1st:多中心研究–北京大学人民医院（Elecsys/Vitros/Architect）–上海交通大学新华医院（Elecsys/Vitros）–四川大学华西医院(Elecsys/Lizvon/Intec)2nd:特殊样本的评估–卫生部临检中心（多种方法）灵敏度–血清转换盘样本–日常检测阳性样本–临检中心早期感染样本特异性–实验室常规检测样本确认方法：–MIKROGEN®RIBAHCV–CHIRON®RIBAHCV3.0–Cobas®TaqmanHCVRNA应用血清转换盘评估灵敏度Elecsys®Anti-HCVII灵敏度最高血清转换盘是客观评价早期感染灵敏度的标准常规样本的评估北京大学人民医院(n=830)样本数N=830Elecsys®Anti-HCVIIVitros®Anti-HCVArchitect®Anti-HCV阳性真阳性17171716假阴性001阴性真阴性813809805805假阳性488统计灵敏度100%100%94%特异性*99.50%99.02%99.02%阳性率2%*RIBA不确定+RNA(-)结果解释为阴性常规样本的评估上海交通大学新华医院（n=495)样本数N=495Elecsys®Anti-HCVIIVitros®Anti-HCV阳性真阳性111假阴性00阴性真阴性494494492假阳性02统计灵敏度100%100%特异性*100%99.60%阳性率0.2%*没有HCVRNA结果,排除RIBA不确定样本常规样本的评估四川大学华西医院(n=1044)样本数N=1044Elecsys®Anti-HCVIIElecsys®Anti-HCVIntec®Anti-HCVLizvon®Anti-HCV阳性真阳性88877假阴性8811阴性真阴性10361034102210361034假阳性21402统计灵敏度100%100%88%88%特异性*99.8198.64%100%99.81%阳性率0.8%*没有HCVRNA结果,排除RIBA不确定样本预选样本的评估北京大学人民医院（n=67)RIBA不确定样本的RNA结果均为(-)低S/CO样本中20%是真正阳性入选:Vitros(+)S/CO8预选样本的评估北京大学人民医院（n=67)灵敏度：92%特异性*：93%灵敏度：92%特异性*：63%*RIBA不确定+RNA(-)结果解释为阴性早期感染样本的灵敏度评估1方法Elecsysanti-HCVIIABCDEFG有反应性11092989291868687灵敏率87.2%69.2%76.7%69.2%68.4%64.7%64.7%65.4%具体样本组成RIBA（+）99RNA（+）121RNA(-)&RIBA(+)RNA(+)&RIBA(+)RIBA(-)/IND&RNA(+)1287341卫生部临检中心评估数据HCVRNA和/或RIBA阳性（n=133)特异性评估1方法Elecsysanti-HCVIIABC有反应性2213842无反应性305286269265特异性99.35%93.16%87.62%86.32%方法Elecsysanti-HCVIIABC有反应性3411611477无反应性385303315342特异性91.89%72.23%75.18%81.63%1卫生部临检中心评估数据RNA&RIBA阴性（n=307)RNA阴性&RIBA不确定(n=419)判定真阳性的Cutoff的初步分析1基于全部1072例/243例确认阳性样本方法S/COnS/CO假阳性真阳性率S/COn1-S/CO假阳性真阳性率Elecsys15068593%1-501754674%4587990%1-451564472%401101091%1-401334368%301441490%1-30993661%VITROS2882890%1-818913031%VITROS文献320可以确定阳性感染893%3LaiKK,JinM,YuanS，etal.ImprovedreflexivetestingalgorithmforhepatitisCinfectionusingsignal-to-cutoffratiosofahepatitisCvirusantibodyassay.ClinChem.2011;57(7):1050-6.1卫生部临检中心评估数据；2两种方法基于基本相同样本的分析；总结应该对目前使用的方法与试剂有充分的了解应选用高灵敏性的HCV初筛的抗体检测方法，减少漏检关注特异性，采取正确的检测策略，减少假阳性先RIBA后核酸的方式更适合低流行区域中国的感染状态复杂在低S/CO的人群中，有近20%比例是可以确认阳性的高于美国CDC推荐S/CO的样本，是否可以达到95%的特异性，尚需针对中国人群样本的分析致谢卫生部临检中心王露楠教授北京大学人民医院杨瑞峰魏来教授上海交通