HPLC法测定肉制品中苯并芘含量的不确定度评估

HPLC法测定肉制品中苯并芘含量的不确定度评估1.材料与方法1.1主要仪器和试剂1.1.1仪器Agilent1260高效液相色谱仪，电子天平AL2041.1.2试验试剂乙腈、甲醇、二甲亚砜、环己烷（色谱纯）、无水硫酸钠、苯并芘标准品201509（20μg/mL）1.1.3仪器条件色谱柱C18（4.6mm*250mm*5μm）,柱温为35℃。流动相：甲醇+水（90+10）流速：1.0mL/min,荧光检测器：激发波长364nm;发射波长427nm,进样量50μL。1.2试验方法及数学模型1.2.1样品制备称取5.0g样品于50mL离心管，加入5g无水硫酸钠，加入20mL环己烷均质，再用10mL环己烷清洗均质头，3500r/min离心5min,上清液倒入鸡心瓶，40℃减压浓缩至1mL左右，分别用2mL环己烷清洗鸡心瓶2次，合并倒入50mL离心管中，分别加入5mL二甲亚砜涡旋2min萃取2次，离心取下层，合并2次二甲亚砜萃取液于50mL离心管，加入10mL2.0g/LNa2SO4溶液，加入20mL环己烷涡旋反萃取，离心后取上层于鸡心瓶，40℃减压浓缩，用1mL甲醇溶解，0.25μm微孔滤膜过滤，上机测试。1.2.2标准溶液的配制标准中间液配制：用1mL移液管移取0.5mL苯并芘标准储备液（20μg/mL）至100mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到苯并芘标准溶液的浓度为100ng/mL。标准曲线绘制：用1mL移液管分别移取0.25mL、0.50mL、1.0mL、2.0mL、2.5mL苯并芘标准中间液（100ng/ml）至10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，浓度为2.5ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL、20.0ng/mL、25ng/mL。分别吸取10μL进样，以峰面积为纵坐标，以苯并芘浓度为横坐标，绘制标准曲线。1.2.3数学模型X=𝐶×V×1000𝑚×1000式中：X-------------试样中苯并芘含量，单位μg/kg;C-------------标准曲线中查得的样液中苯并芘的浓度，单位为ng/mL；V-------------样液最终定容体积，单位mL；m------------称样量，单位为g1.3不确定度来源分析根据苯并芘不确定度数学模型分析其来源如下图1所示2.结果与分析由试验方法的数学模型及检测过程分析，可判断影响过程不确定度的主要来源为标准溶液的配制过程、样品称量过程、样品定容体积所引入的不确定度。2.1标准溶液的相对不确定度Urel1从配置标准溶液的过程中，可以分析标准溶液引入的不确定度主要来源于标准物质的纯度，标准溶液的移取及标准溶液的定容，需要分别评定各个分量不确定度后合成2.1.1标准样品纯度引入的不确定度urel1由苯并芘标准物质证书可知其相对扩展不确定度（%）（k=2）0.8,服从正态分布，则相对标准不确定度urel1=0.008/2=0.0042.1.2标准溶液配制中10mL容量瓶产生的不确定度urel2玻璃器具的不确定度来源主要是两个方面：一．玻璃器具示值偏差的不确定度，按照JJG196-2006《常用玻璃量具检定规程》给出的不同计量器具的允许差，按照均匀分布考虑，不确定度uv=δ/√3二．玻璃器具使用温度与校准温度差异引入的不确定度，玻璃器具以20℃为标准二校准的，本例操作温度与校准温度相差±4℃，水的膨胀系数为0.0002℃，按照均匀分布计算，水的温差效应导致玻璃器具体积变化所引入的不确定度用uT=0.002×4×𝑉√3表示。合成标准不确定度为u(V)=√𝑢𝑣2+𝑢𝑇2,相对不确定度为urel(V)=𝑢(𝑉)𝑉,按照上述评定方法，标准工作溶液配制过程中使用了一系列玻璃器具所引入的不确定度结果见下表1：玻璃器具规格（A级）最大允许误差（mL）不确定度uv=δ/√3不确定度uT=0.002×4×𝑉√3标准不确定度u(V)=√𝑢𝑣2+𝑢𝑇2相对标准不确定度urel(V)=𝑢(𝑉)𝑉100mL容量瓶0.1000.057740.0484970.075400.0007545mL移液管0.0250.014430.0024250.014640.0029272mL移液管0.0120.006930.0009700.007000.0034981mL移液管0.0070.004040.0004850.004070.004070由表1中数据核查相对不确定度为：urel2=√0.0007542+0.0029272+0.0034982+0.0040702=0.00616所以，由标准物质纯度、标准物质的称量、玻璃器具校准和温度变化的标准不确定度分量合成标准溶液的相对标准不确定度为：Urel1=√𝑢𝑟𝑒𝑙12+𝑢𝑟𝑒𝑙22=√0.00042+0.006162=0.007342.2样品试样制备过程引入的相对不确定度Urel22.2.1称量不确定度的来源urel1天平校准：使用天平型号AL204万分之一的电子分析天平，校准不确定度为：0.0002g。称样量m=5.00g，则urel1=0.00025.00=0.00004。2.2.2样品定容过程引入的不确定度urel2样品最终氮吹近干，甲醇溶解，定容至1mL。定容过程使用1mL移液管，根据检定可知，其最大允许误差为：±0.007mL，查表1可知，urel2=0.004070。所以，样品试样制备过程引入的相对不确定度Urel2==√𝑢𝑟𝑒𝑙12+𝑢𝑟𝑒𝑙22=√0.00042+0.0040702=0.004092.3苯并芘测定结果的相对不确定度Urel3（含人员、环境、测量方法和仪器重复性等其他分量的贡献）按照1.2.1方法对肉制品中苯并芘进行了6次独立测试，测试结果如下表2：苯并芘：s=√∑(𝑥𝑖−𝑥̅)2𝑛𝑖=1𝑛−1=√0.014196−1=0.0533Urel3=𝑠𝑥̅=0.05330.9083=0.05872.4总相对不确定度合成总的相对标准不确定度为𝑈𝑟𝑒𝑙=√𝑈𝑟𝑒𝑙12+𝑈𝑟𝑒𝑙22+𝑈𝑟𝑒𝑙32=√0.007342+0.004092+0.05872=0.05932.5扩展标准不确定度取置信概率p=95%,则包含样子k=2,计算扩展不确定度U:合成标准不确定度𝑢𝑐=𝑈𝑟𝑒𝑙×𝑥̅=0.0593×0.9083=0.0539U=k×𝑢𝑐=0.108项目苯并芘含量（μg/kg）nixix-x(ix-x)210.93150.023200.00053820.99950.091200.00831730.9059-0.002400.00000640.8986-0.009700.00009450.8542-0.054100.00292760.8603-0.048000.002304x0.9083∑(𝑥𝑖−𝑥̅)2𝑛𝑖=10.014192.6报告不确定度用高效液相色谱法测定肉制品中苯并芘的含量，测量6份样品，取其平均值报告结果，其结果和扩展不确定度为：0.910.11μ/k