HPVSOP-不带提取

人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒（荧光PCR法）标准操作流程一、目的：规范实验室操作，正确使用PCR扩增仪进行HPV-DNA扩增分析，以保证实验结果的准确性。二、适用范围：人乳头状瘤病毒(HPV)基因分型检测试剂盒在扩增仪上进行扩增以及分析。三、职责：由临床分子生物实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。四、程序：【检验方法】1.试剂准备（试剂准备区）a)从-20℃取出试剂盒，将各试剂融化混匀并短暂离心后备用。计算需要进行的反应份数n（n=待测样本数+空白对照1份+阳性对照1份）。b)取出8个离心管分别标记1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#和8#，分别加入n×10μl核酸扩增反应液，然后对应每个编号离心管分别加入n×8μlA反应液（1#）、n×8μlB反应液（2#）、n×8μlC反应液（3#）、n×8μlD反应液（4#）、n×8μlE反应液（5#）、n×8μlF反应液（6#）、n×8μlG反应液（7#）、n×8μlH反应液（8#）。c)混匀并短暂离心后，依次分装至对应编号PCR八联管中，每管18μl，总共分装n排PCR反应八联管，1排PCR八联管为1人份。2.加样（1）小心打开PCR八联管盖，每份待测样本核酸溶液、空白对照按照2μl/管依次加入对应编号含有A-H反应体系的PCR八联管中，1排PCR八联管为1人份，阳性对照（A-H组）同样按照2μl/管分别加入对应的A-H反应体系的PCR八联管中，总体积为20μl/管。（2）盖紧PCR八联管盖，低速短暂离心。3.PCR扩增检测（核酸扩增区）3.1将反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。3.2循环参数设定（请参照仪器的操作说明进行设置）步骤温度时间循环数1UNG酶处理50℃5min1cycle2预变性95℃10min1cycle3变性95℃10s45cycles退火、延伸及检测荧光58℃40s步骤3中58℃时荧光检测，检测通道选择为：FAM、HEX、ROX4.结果分析4.1杭州博日Linegene9600荧光定量PCR仪：反应结束保存结果，根据分析后图像调节基线的起始循环、终止循环（可以根据实际情况自行调整，起始循环可以在3~15、终止循环可设在5~20，调整空白对照的扩增曲线平直或低于阈值线；也可由仪器进行自动判读，起始循环为3、终止循环为15），点击确定自动获得分析结果，在同一界面的显示区察看结果。4.2上海宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪：反应结束自动保存结果，根据分析后图像调节基线起点、终点、阈值；也可由仪器进行自动判读，默认起始循环为6、终止循环为12、阈值为0.12），点击分析自动获得分析结果，在同一界面察看结果。4.3将各个样本的信息与结果输入定量分析软件计算各自的病毒裁量。【参考值（参考范围）】1.根据临床试验结果，利用ROC曲线法最终确定本试剂盒的HPV各亚型的定性参考值，见下表。HPV亚型探针荧光标识表及参考值组别探针标记HPV亚型参考值组别探针标记HPV亚型参考值A组FAMHPV1636.9E组FAMHPV6835.2HEXHPV1836.2HEXHPV5134.6ROXHPV3135.5ROXHPV3935.5B组FAMHPV5934.8F组FAMHPV8235.8HEXHPV6636.5HEXHPV2635.5ROXHPV5335.3ROXHPV7335C组FAMHPV3335.7G组FAMHPV634.6HEXHPV5835.4HEXHPV1137ROXHPV4535ROXHPV8135.6D组FAMHPV5636H组FAMFAM参考基因36.7HEXHPV5235.1HEXROXHPV3534.5ROX5.检验结果的解释质量控制1．空白对照：无典型S型扩增曲线显示。2．阳性对照：HPV21个亚型及参考基因检测呈典型S型扩增曲线且CT值≤30。3．参考基因：H组FAM通道扩增曲线呈典型S型曲线且CT≤36.7，否则与样本采样、运输、保存条件及实验操作等导致的失误有关。4．以上要求需在同一实验中同时满足，否则本次实验定性结果无效。结果判读在仪器正常，空白对照、阳性对照、H组的FAM通道均正常的情况下，根据HPV亚型探针荧光标识表进行分析。1.HPV亚型定性分析根据参考值（参考范围），在A-H组中的HPV亚型扩增曲线呈典型S型曲线且CT值小于参考值，判断相应的HPV亚型为阳性；无典型S型扩增曲线或CT值大于参考值，判断相应的HPV亚型为阴性。