IPTG诱导蛋白表达全面介绍

IPTG全面介绍：优点·使用·配制·特点摘要:异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。IPTG常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。它常与X-Gal或Bluo-Gal结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac操纵子在大肠杆菌中的表达。IPTG与lacI阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ的抑制。中文名：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)英文名称：Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside用途：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。IPTG常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。它常与X-Gal或Bluo-Gal结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac操纵子在大肠杆菌中的表达。IPTG与lacI阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ的抑制。使用方法：首先把IPTG配制成23.83mg/ml(100mM)的水溶液，并进行过滤除菌后保存。然后在100ml的琼脂培养基中，加入100μl的上述溶液、200μl的X-Gal(20mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100μl的Amp(100mg/ml)，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。当dna片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体)，然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。配制方法：在8ml蒸馏水中溶解2gIPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。优点：1.能诱导酶的合成，但又不被分解的分子，称为安慰诱导物。由于乳糖虽可诱导酶的合成，但又随之分解，产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。2.IPTG不被菌体代谢，为乳糖类似物，一旦进入细胞就会产生持续长久的诱导效果，所以IPTG的诱导效率高，往往只需要很少量(1mmol/L)即可达到理想诱导效果。由于IPTG不被代谢，在胞内专一诱导外源蛋白的表达。不受细胞代谢的影响，诱导效果持续稳定。乳糖有双效作用，既能做为诱导剂异乳糖的前体物质，又可以做碳源，在诱导过程中，很不稳定，IPTG因其优异的稳定性决定了它适合做实验研究用。3.IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被抄送。4.半乳糖苷键中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同，IPTG虽不为β–半乳糖苷酶所识别，但它是lac基因簇十分有效的诱导物。注意事项：培养噬菌体时，Topagar中的添加量为：25μl/3ml(24mg/ml)。含有IPTG的培养基4℃避光保存，须在1~2周内使用。保存：2-8°C冷藏保存，配制好后保存于-20°C，室温可放置一个月。远离热源及氧化剂。IPTG诱导蛋白表达的原理.材料.实验方法摘要:E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动子序列P及一个调节基因I.I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点.由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动子序列P及一个调节基因I.I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点.由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达.在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态.此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动.当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导.在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身.乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖.后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录.异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用.材料：1、诱导表达材料：(1)LB(Luria—Bertani))培养基：酵母膏(Yeastextract)5g蛋白胨(Peptone)10gNaCl10g琼脂(Agar)1-2%蒸馏水(Distilledwater)1000mlpH7.0适用范围：大肠杆菌(2)IPTG贮备液：2gIPTG溶于10mL蒸馏水中,0.22μm滤膜过滤除菌,分装成1mL/份,-20℃保存.(3)l×凝胶电泳加样缓冲液：50mmol/LTris-CI(pH6.8)50mmol/LDTT2%SDS(电泳级)0.1%溴酚蓝10%甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料：1)酶溶法(1)裂解缓冲液：50mmol/LTris-CI(pH8.0)1mmol/LEDTA100mmol/LNaCI(2)50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF).(3)10mg/mL溶菌酶.(4)脱氧胆酸.(5)1mg/mLDNaseI.2)超声破碎法(1)TE缓冲液.(2)2×SDS-PAGE凝胶电泳加样缓冲液：100mmol/LTris-HCI(pH8.0)100mmol/LDTT4%SDS0.2%溴酚蓝20%甘油实验方案：1、外源基因的诱导表达：(1)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因.(2)按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌.(3)筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱,DNA序列测定,确定无误后进行下一步.(4)如果表达载体的原核启动子为PL启动子,则在30-32℃培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6,迅速使温度升至42℃继续培养3-5h;如果表达载体的原核启动子为tac等,则37℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1mmol/L.继续培养3-5h.(5)取上述培养液1mL,1000g离心,1min,沉淀,加100μL聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS-PAGE检测.2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化：细菌的裂解常用方法有：①高温珠磨法;②高压匀浆;③超声破碎法;④酶溶法;⑤化学渗透等.前三种方法属机械破碎法,并且方法①、②已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛.下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤.酶溶法.常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3-葡聚糖酶;β-1,6-葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等.溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著.主要步骤为：4℃,5000rpm离心,15min,收集诱导表达的细菌培养液(100mL).弃上清,约每克湿菌加3mL裂解缓冲液,悬浮沉淀.试验进行到了IPTG诱导表达后跑SDS-PAGE胶的环节，首先，我获得了我的目的基因，与pET28a连接后，成功构建载体。我进行了菌液PCR验证，质粒PCR验证，质粒双酶切验证，之后是送去测序。所有的结果足够表明我已经构建载体成功了。之后就是转化BL21表达菌株中。转到BL21表达菌株时间大概是15年1月份左右，直到过年后回来开始摇菌，诱导，跑胶，问题就是这时候出现的。以下是我做试验的整个流程，望大神给些建议。1、诱导与提取目的蛋白①菌种活化。重组载体pET-28a-SAMDC和空质粒pET-28a的单菌落，分别接种于25mLLB液体培养基（KanR）的试管中，37℃，180r/min，过夜振荡培养。②菌种扩培。取活化好的菌种按1%的量接种于100mL的LB液体培养基（KanR），摇匀，37℃，200r/min，振荡培养3h。③融合蛋白的诱导表达。向菌液中分别加入终浓度的IPTG（0.1、0.5、1.0mmol/L）作诱导剂，37℃，180r/min，振荡培养4h（3、4、5、6h）。④目的蛋白的提取。A.经诱导后取1mL菌液，4℃12000g，10min收集菌体;吸出菌液，用0.5mL预冷的50mmol/LTris-Cl（pH7.4）漩涡振荡使沉淀的菌体复悬，4℃12000g，离心10min；再次吸出上清液，小心地吸净管壁上的液滴，尽可能地使沉淀不带有残留的液体；加入100uLddH2O，漩涡振荡使沉淀复悬，一旦菌体分散开来立即加入等体积的1%×SDS磷酸缓冲液，继续振荡20s；超声波处理。超声处理为7min，超3s，停10s，功率为75w。超声波处理后，样品4℃12000g，10min，将上清移至另一管中，沉淀用少量1%SDS溶解，分别加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液；快速离心，将菌悬液收集在离心管底部，沸水浴中放置5min；分别取15uL样品进行SDS-PAGE电泳检测。图片即为SDS胶跑完后的状态。我的蛋白预测应该是在40kDa左右，可是在40kDa左右处根本没有我的目的蛋白。反而在30kDa处出现奇怪的条带...做了几次都是这样的状态。同实验室的也有人在做这一步，她的蛋白预测大小为38kDa，但是跑出来的胶跟我的一模一样。还有一个同学她是前两次做成功了可以明显看到目的蛋白表达，在60kDa左右，但是从大概4月份开始条带就没有了，我们一直找不到原因，难道这个也是可以传染的？去问实验室的小老师，老师说可能是我们IPTG诱导的时间有问题，但是按照他说的方法重新试了也不行。难道是因为驯化时间太久所以BL21这个菌太淘气了所以把我们的载体吐出去了？但是这种可能性也不算大啊，我们也没有反复冻融，更何况我们重新验证了，BL21菌株中确实有我们的质粒。现在真的是想不出来到底问题出在哪里。唯一能想到的就是IPTG失效了，下次准备把所有的试剂都重新配一遍，再重新来一次。还有别的什么原因会出现这样的情况么？如果胶做的不对会使条带消失么？？求！！！！！！！！跪求！！！！！！！！谢谢大家了。