ITS总结

ITS技术在真菌鉴定中的应用专业：生物化学与分子生物学学号：2012111277姓名：段硕楠ITS技术在真菌鉴定中的应用一摘要：真菌种类繁多,仅依靠形态、生化等表型特征来鉴定真菌既需要丰富的真菌鉴定工作经验又需要较长的检验时间,尤其对于那些生长条件特殊、形态相似的菌株要通过传统的表型特征鉴定方法来加以鉴别显得非常困难。而基于rDNA-ITS的多态性(包括长度多态性和序列多态性)的序列分析,由于可以从不太长的核酸序列中获得相对足够的信息用来反映生物亲缘关系与分类情况,因而成为真菌分类及鉴定研究的热点,目前已广泛应用于真菌的属种间[2,3]及部分种内组群水平[4,5,15]的系统学研究。本文通过PCR扩增与测序的方法对ITS序列分析在真菌的分子生物学鉴定中的应用作初步的介绍与分析。真菌核糖体基因转录间隔区（internaltranscribedspacerITS），又叫内转录间隔区，是位于真菌核糖体DNA（rDNA）上18S和28S基因之间的区域片段，主要包括内转录间隔区1（ITS1）、5.8SrDNA、内转录间隔区2（ITS2），其两侧分别是18SRNA基因和28SRNA基因。虽然ITS1和ITS2是核糖体转录单位中的一部分，但这些序列并不转录成RNA，它们只是在核糖体RNA成熟过程中起着重要作用［1］。真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5.8SrDNA4种,它们在染色体上头尾相连、串联排列,相互之间由间隔区分隔。其中18S、5.8S和28SrDNA基因组成一个转录单元(图1)。rDNA在种内由于基因的流动而经常表现出很高的同源性，在种间则保持着各种程度的变异。变异的多少能够反映生物进化上属内种间亲缘关系的远近。最常见的变异是ITS上的单个碱基的替换，其次是碱基的插入或缺失。与核糖体DNA中的18S、5.8S和28S的基因组序列相比较，ITS1和ITS2作为非编码区，承受的进化选择压力较小，相对变化较大，在种间表现出较高的差异，可以为研究真菌的分类鉴定和分子检测提供丰富的遗传信息。Gonzalea于1990年提出利用ITS作为全新的分子标记，由于该分子标记技术具有快速、准确、微量、灵敏度高、程序简单等优点，现已广泛应用于真菌的分类鉴定、检测和病害诊断。二实验材料与方法：1.子实体和菌丝体粉末的获得：将子实体和从发酵液中抽滤所得的菌丝体冷冻干燥，将干燥的子实体或菌丝体放入液氮中研磨粉碎，样品研成粉末，放置于1.5ml的EP管中，放入-20℃备用。2.CTAB法提取DNA：【原理】CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/LNaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。【步骤】（1）2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。（2）取少量实验材料（约300mg）置于研钵中，用液氮磨至粉状；（3）加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；（4）将磨碎液分倒入1.5ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10min轻轻摇动，30~60min后取出；（6）冷却2min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3min（若提取的是总基因组，则不能剧烈震荡。），使两者混合均匀；（7）放入离心机中10000rpm离心10min，与此同时，将600ul的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；（8）10000rpm离心1min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；（9）10000rpm离心1min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；（10）60sec后，直立离心管，加入720ul的75%乙醇及80ul5M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；（11）放置30min，使DNA块状物的不纯物溶解；（12）10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入800ul75%的乙醇，将DNA再洗30min；（13）10000rpm离心30sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；（14）加入50ul0.5×TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15h，使RNA消解.3.PCR扩增DNA：【原理】DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。【反应体系】10*PCRbuffer5uldNTP2.5ulITS12.5ulITS42.5ulTaqE0.5ulDNA模版2.5ulddH2O34.5ul【实验步骤】94℃5min预变性→94℃30s变性→52℃30s退火→72℃30s延伸→72℃10min充分延伸→第二步到第四部重复30个循环，得到扩增产物。3.琼脂糖凝胶电泳：【原理】琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。通过凝胶中的DNA条带来确定ITS序列是否被扩增出来。将被扩增出的条带对应它的PCR产物进行碱基测序，将测序结果发送到NCBIBlast进行测序比对，从而能鉴定出蘑菇的属和属内各种的相似度。三前景与展望利用ITS序列对真菌进行鉴定和分子检测，弥补了传统鉴定和检测方法的不足，具有广阔的应用前景。ITS区域在不同菌株间存在丰富的变异。对ITS区进行序列分析不仅丰富了真核生物核糖体基因ITS的序列信息，为病原菌的分类鉴定及系统发育等研究提供了十分重要的依据，而且为建立病原菌的分子监测与疫病的快速诊断技术奠定了基础，对植物病害的防治具有一定意义。随着科学家的研究深入，对真菌的ITS分子检测已经应用到动物致病菌的范围。彭慧等采用PCR-RFLP方法对因眼外伤摘除的眼球活组织中培养分离出的一株形态特异的尖端赛多孢子菌的ITS序列进行了分析。结果发现，形态特异的尖端赛多孢子菌与标准株及其他同种菌株具有相同的酶切图谱，从而证实该标准菌株的ITS序列酶切图谱可供快速、准确地鉴定尖端赛多孢子菌。王英等采用2对内转录间隔区ITS的种特异性引物和通用引物对念珠菌悬浮液进行扩增。结果发现，采用通用引物结合快速检测法可快速、简便、特异、敏感地检测出念珠菌，并能同时鉴定到种，这对念珠菌病的早期诊断和治疗有潜在的应用价值。