LC培训讲义1-9

液相色谱培训讲义(一)作者：转载自：发布日期：2007-5-21第一章绪论色谱分析法是分析化学中获得广泛应用的一个重要分支，从本世纪初俄国植物学家茨维特(M．S．Tswett)提出经典液相色谱法后，色谱分析法取得迅速发展，30～40年代发展了柱分配色谱、纸色谱；50年代发展了气相色谱法，薄层色谱法；60年代发展了凝胶色谱法及高效液相色谱法；70年代发展了高效毛细管气相色谱法；80年代发展了毛细管电泳和电色谱；90年代又出现了光色谱。所有上述各种色谱技术的发展过程，都表明了色谱分析法是一个具有强大生命力的分离分析技术。第一节高效液相色谱法的特点作为色谱分析法的一个分支，高效液相色谱法是在本世纪60年代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型分离分析技术。液相色谱包括传统的柱色谱、薄层色谱和纸色谱。50年代后气相色谱法在色谱理论研究和实验技术上迅速崛起。而液相色谱技术仍停留在经典操作方式，其操作繁琐，分析时间冗长，因而未受到重视。60年代以后，随着气相色谱法对高沸点有机物分析局限性的逐渐显现，人们又重新认识到液相色谱法可弥补气相色谱法的不足之处。60年代末随着色谱理论的发展，色谱工作者已认识到采用微粒固定相是提高柱效的重要途径，随着微粒固定相的研制成功，液相色谱仪制造商在借鉴了气相色谱仪研制经验的基础上，成功地制造了高压输液泵和高灵敏度检测器，从而使液相色谱法获得新生。从分析原理上讲，高效液相色谱法和经典液相(柱)色谱法没有本质的差别，但由于它采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。经过近30年的发展，现在高效液相色谱法在分析速度、分离速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化方面，都达到了和气相色谱法相媲美的程度，并保持了经典液相色谱对样品适用范围广、可供选择的流动相种类多和便于用作制备色谱等优点。至今，高效液相色谱法已在生物工程、制药工业、食品工业、环境监测、石油化工等领域获得广泛的应用。高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography)还可称为高压液相色谱(HighPressureLiquidChromatography)、高速液相色谱(HighSpeedLiquidChromatography)或现代液相色谱(ModernLiquidChromatography)。一、与经典液相(柱)色谱法比较经典液相(柱)色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，仅有低柱效，分析时间冗长。高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填在小口径，短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。经典液相(柱)色谱法和高效液相色谱法的比较可见表1-1。表1-1高效液相色谱法与经典液相(柱)色谱法的比较方法项目高效液相色谱法经典液相（柱）色谱法色谱柱：柱长/cm柱内径/mm10～252～1010～20010～50固定相粒度：粒径／μm筛孔／目5～502500～30075～600200～30色谱柱入口压力／MPa2～200.001～0.1色谱柱柱效／(理论塔板数／m)2×103～5×1042～50进样量／g10-6～10-21～20分析时间／h0.05～1.01～20二、与气相色谱法比较高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有选择性高、分离效率高、灵敏度高，分析速度快的特点，但它仅适于分析蒸气压低、沸点低的样品，而不适用于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。在全部有机化合物中仅有20％的样品适用于气相色谱分析。高效液相色谱法却恰可弥补气相色谱法不足之处，可对80％的有机化合物进行分离和分析，此两种方法的比较可见表1-2。表1-2高效液相色谱法与气相色谱法的比较方法项目高效液相色谱法气相色谱法进样方式样品制成溶液样品需加热气化或裂解流动相1、液体流动相可为离子型、弱极性、非极性溶液，可与被分析样品产生相互作用，并能改1、气体流动相为惰性气体，不与被分析的样品发生相互作用。2、气体流动相动力粘度为善分离的选择性。2、液体流动相动力粘度为10-3Pa·s，输送流动相压力高达2～20Mpa。10-5Pa·s，输送流动相压力仅为0.1～0.5Mpa。固定相1、分离机理：可依据吸附、分配、筛析离子交换、亲和等多种原理进行样品分离，可供选用的固定相种类繁多。2、色谱柱：固定相粒度小为5～10μm；填充柱内径为3～6mm，柱长10～25cm，柱效为103～104；毛细管柱内径为0.01～0.03mm，柱长5～l0m，柱效为104～105；柱温为常温1、分离机理：依据吸附，分配两种原理进行样品分离，可供选用的固定相种类较多。2、色谱柱：固定相粒度大0.1～0.5mm；填充柱内径为1～4mm，柱长1～4m，柱效为103～104；毛细管柱内径为0.1～0.3mm，柱长10～l00m，柱效为103～104；柱温为常温～300℃检测器选择性检测器：UVD，PDAD，FLD，ECD通用型检测器：ELSD，RID通用型检测器：TCD，FID(有机物)选择性检测器：ECD，FPD，NPD应用范围可分析低分子量低沸点样品；高沸点、中分子、高分子有机化合物(包括非极性、极性)；离子型无机化合物；热不稳定，具有生物活性的生物分子可分析低分子量、低沸点有机化合物；永久性气体；配合程序升温可分析高沸点有机化合物；配合裂解技术可分析高聚物仪器组成溶质在液相的扩散系数(10-5cm2／s)很小，因此在色谱柱以外的死空间应尽量小，以减少柱外效应对分离效果的影响溶质在气相的扩散系数(10-1cm2/s)大，柱外效应的影响较小，对毛细管气相色谱应尽量减小柱外效应对分离效果的影响*注：UVD——紫外吸收检测器；PDA/DAD——二极管阵列检测器；FLD——荧光检测器；ECD——电化学检测器；RID——示差折光检测器；ELSD——激光蒸发光散射检测器；TCD—热导检测器；FID——氢火焰离子化检测器；ECD——电子捕获检测器；FPD——火焰光度检测器；NPD——氮磷检测器。三、高效液相色谱法的特点通过以上介绍可知高效液相色谱法具有以下特点：(1)分离效能高由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色谱填充柱的柱效可达2×103～5×104块／m理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱103块／m理论塔板数的柱效。(2)选择性高由于液相色谱柱具有高柱效，并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机化合物及其同分异构体，还可分析在性质上极为相似的旋光异构体，并已在高疗效的合成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重要作用。(3)检测灵敏度高在高效液相色谱法中使用的检测器大多数都具有较高的灵敏度。如被广泛使用的紫外吸收检测器，最小检出量可达10-9g；用于痕量分析的荧光检测器，最小检出量可达10-12g。(4)分析速度快由于高压输液泵的使用，相对于经典液相(柱)色谱，其分析时间大大缩短，当输液压力增加时，流动相流速会加快，完成一个样品的分析时间仅需几分钟到几十分钟。高效液相色谱法除具有以上特点外，它的应用范围也日益扩展。由于它使用了非破坏性检测器，样品被分析后，在大多数情况下，可除去流动相，实现对少量珍贵样品的回收，亦可用于样品的纯化制备。液相色谱培训讲义（二）作者：转载自：发布日期：2007-5-9第二章高效液相色谱流程和设备图2-1高效液相色谱仪的流程示意图图2-1表示了一台典型高效液相色谱仪的流程示意图。泵吸入溶剂瓶中的流动相，经压力和流量测量，然后输出进入进样器。被分析样品由进样器注入，并随流动相一起依次通过保护柱（非必须部件)、分离柱后进入检测器。检测信号用微处理机采集和进行数据处理，或用积分仪（或记录仪）记录色谱峰面积和色谱图。如果不是分析而是制备目的，可以使用馏分收集器。遇到复杂样品可以采用梯度淋洗操作（借助于梯度控制器），使样品各组分均得到最佳分离，且能花费更少的时间。整个仪器也可使用一台微处理机操纵，包括数据处理和操作控制。需要特别指出的是，关于色谱仪的几个主要部件的性能问题，如泵的耐压性，流量的稳定性，检测器的灵敏度和整机的稳定性等，生产厂家一般都能给予足够的重视，但往往容易忽略“柱外效应”的影响。过大的柱外死体积会明显地损失柱效，从而导致总的分离能力下降，特别是当柱径减小到2mm或更小时。下面简要介绍高效液相色谱设备中各部件的基本特点，以了解其概貌。至于各部分的细节将是以后各章讨论的主要内容。一、输液泵泵是一套高效液相色谱设备中重要的单元部件，是驱动溶剂和样品通过色谱分离柱和检测系统的高压源，其性能好坏直接影响整个仪器和分析结果的可靠性。用于分析目的泵应当流量稳定(±1％)，耐高压(30～60MPa)，能耐各种流动相，如有机溶剂、水和缓冲液。目前，高效液相色谱仪普遍采用体积小、方便多用的往复泵和隔膜泵。以往复泵为例，又有单、双和三泵头结构之分，显然，在单泵头的情况下，如果没有必要的补偿机构，脉动较大；若改为双泵头或三泵头，交替动作的柱塞分别以180°和120°的相位差排液和吸液，则输出液流的脉动大为改善。因而后两种往复泵更受欢迎。对于分析极性范围宽或分子体积相差较大的复杂混合物，为了能在较短的时间内对所有各组分均实现满意的分离，常采用梯度淋洗操作。梯度洗脱又称溶剂程序，就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置可分为以下两类：（1）低压梯度洗脱装置，又称外梯度。它是一种在常压下洗脱液按预先规定的比例混合后，再由高压泵输入色谱柱，所以也称泵前混合。（2）高压梯度又称为内梯度，它是将溶剂于高压泵加压后再混合的梯度洗脱装置。梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。用于刚性微粒装填的高压泵多是气动泵和往复泵，主要恒量指标是能产生高压(40～100MPa)和较大的排液量(10至数10mL／min)。这是自行装柱的实验室所必需设备。二、色谱柱人们常说色谱柱是色谱仪的心脏，因为色谱的核心问题——分离，是在这里进行的。在色谱发展史上，色谱柱填料与柱技术的发展一直是色谱工作者共同关心的问题，可以说，液相色谱的每—个重大发展都和色谱柱的每一次突破密切相关。为适应不同的分离分析要求，可有不同的柱型，内装不同性质的填料。最常使用的色谱柱是10～30cm长，2～5mm内径的内壁抛光的不锈钢管柱，内装5～10μm高效微粒固定相。采用高压匀浆装柱技术填充。相同柱长的效率远远高于气相色谱，以2mm细内径柱为例，250cm长的5微米YWG硅胶柱柱效可达20000理论塔板，而5微米YQG—CH反相键合相往往可达14000理论塔板，高效柱的填充需要特殊的设备和技术，国际上各色谱仪和色谱产品厂家均提供预装柱。三、进样器被分析样品从柱头进样器引入的方式可分为注射器进样、停流进样、阀进样和自动进样器进样四种，其中注射器和阀进样为最常用。在10MPa以下的进口压力可用1～10μL的微量注射器进样，在这种情况下一般能获得最高的柱效率，但进样重复性不佳，特别是在较高压力下。阀进样是比较理想的，进样体积可变，也可以固定，但一般说来，柱效受些影响。自动进样器适合于多样品重复操作，便于用微处理机控制，实现自动化。四、检测器被分析组分在柱流出液中浓度的变化可通过检测器转化为光学的或电学的信号而被检出，是色谱仪的“眼睛”。检测器性能的好坏直接关系着定性定量分析结果的可靠性和准确性。在高效液相