微生物的生长繁殖与

第五章微生物的生长繁殖与生存因子一、微生物生长繁殖的概念细菌两次细胞分裂之间的时间称为世代时间。在一定培养条件下，世代时间是一定的。如果营养成分不同，世代时间不同。不同种的微生物，世代时间不同。原核微生物的繁殖速度比真核快，专性厌氧菌的世代时间多数比好氧菌的长。生长生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加繁殖指生物个体数目的增加第一节微生物的生长繁殖一、研究微生物生长的方法微生物生长分个体生长和群体生长。培养方法有分批培养和连续培养。（一）分批培养分批培养是在一个封闭的、有一定体积的液体培养基的容器中接种少量细菌在特定条件下进行培养。在分批培养中微生物只完成一次生长循环。细菌的生长曲线：将少量细菌接种到一定体积的新鲜液体培养基中进行分批培养，定时取样，以细菌数目的对数为纵坐标，培养时间为横坐标，可绘制出细菌的生长曲线。停滞期生长曲线可分：对数期静止期衰亡期1、停滞期（迟滞期或适应期）（lagphase）:将细菌接种到某一培养基后，细菌并不立即繁殖而是经过一段适应期才能生长繁殖。调整适应表现在合成多种酶、完善体内的酶系统及其他细胞成分。特点：（1）细胞质均匀（2）代谢活力强（3）蛋白质和RNA含量增加（4）体积显著增加，许多杆菌可长成长丝状（5）形成诱导酶的能力强（6）对环境变化敏感影响因素：（1）接种量。接种量大，停滞期可缩短（2）菌龄。菌种年轻，对数生长期接种，停滞期可能很短甚至不明显（3）营养。如果种子培养基与新接种的培养基成分相同，则对菌生长有利。从丰富培养基转入贫营养基，停滞时间拉长，反之减少；（4）菌种特性。大肠杆菌停滞期长，分枝杆菌长2、对数期（指数期）logphase细菌生长速度达到最大，数量以几何级数增加。特点：（1）细菌迅速分裂，菌数按几何级数增加；（2）世代时间最短，而且恒定；（3）生长速度最高而且恒定；（4）代谢活力强无死亡；（5）菌体整齐，体积恢复到原来大小；（6）对环境敏感，生理性状及菌体成分较一致世代时间的计算：x2=x1·2n以对数表示：lgx2=lgx1+nlg2生长速率常数平均世代时间影响因素：（1）温度。在适温范围内，每增加10℃，生长速度提高1倍；（2）营养；（3）氧气。好氧菌若能供给充足的氧，可能使对数期延长。3、静止期stationaryphase由于营养消耗，供应不足及代谢产物的积累，这时一部分菌死亡，细菌进入静止期。静止期到来的原因主要是：①营养物尤其是生长限制因子的耗尽；②营养物的比例失调，例如C／N比值不合适等；③酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；④pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。特点：（1）菌数达到最高峰；（2）活菌数达到动态平衡；（3）生长速率为零；（4）开始积累贮存物质影响因素：（1）前期主要是营养，补充营养可延长静止期；（2）后期主要是代谢产物的积累；（3）离子、pH等物化条件失去平衡4、衰亡期declinephase由于营养缺乏和代谢产物积累造成自身中毒，细胞生长受阻，时间和菌数对数呈反比，生长曲线直线下降。特点：（1）生长速率为负值，活菌数减少；（2）细菌发生自溶现象autolysis（3）代谢产物大量积累；（4）形态多变，出现畸形或衰退形。（一）连续培养原理：如果在培养器中不断补充新鲜营养物质并及时不断地以同样速度排出培养物，理论上讲，对数生长期可以无限延长。1、恒浊连续培养不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定的培养方法。根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞。恒浊连续培养可以不断提供具有一定生理状态的细胞，可以得到以最高生长速率进行生长的培养物，在微生物工业上运用此法可得到大量菌体及相应的代谢产物如乳酸、乙醇。2、恒化连续培养维持进水中的营养成分恒定，从而保持细菌的恒定生长速率称恒化连续培养，也称恒组成连续培养。恒化连续培养基中，某种必须的营养物质必须在低浓度作为限制性因子，其他成分过量。这样，细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度。常用的限制性营养物质有作为N源的氨、氨基酸；作为C源的葡萄糖、麦芽糖、乳酸；生长因子、无机盐等。稀释度（率）：新鲜培养基流入的速度为f，培养器中培养液体积为V，稀释度为D=f/V，表示单位时间内，新加入的培养基体积与培养器内培养基总体积之比。随着D增大，细菌浓度先升后降，但在相当大范围内这种变化不明显。当稀释度增大到最大比生长速率时，微生物的增长速率赶不上流出速率，结果必然是到某一时刻，微生物浓度降到维持生长所必需的最低浓度（临界浓度）之下，这时培养器内微生物浓度趋于零。这时的D为临界稀释度。三、细菌生长曲线在废水处理中的应用在废水生物处理时，可利用不同生长阶段的微生物处理废水：常规活性污泥法：减速期，静止期生物吸附法：生长下降阶段（静止期）高负荷活性污泥法：对数期、减速期延时曝气法：衰亡期四、微生物生长量的测定方法可根据菌体细胞量、菌体体积、重量直接测定，也可以根据某种细胞物质的含量或某个代谢活动速度间接测定。微生物生长测量方法个体计数法重量法生理指标法1、测微生物总数（1）计数器直接计数缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。（2）染色涂片计数将已知体积的待测材料均匀涂布在载玻片的已知面积内，染色后显微镜下计数。一般1cm2均匀涂片0.01ml样品。选择几个至十几个视野计数细胞数量。借助镜台测微尺测直径可计算出视野的直径：每ml总数=视野平均菌数×1cm2/视野面积×100×稀释倍数（3）比例计数法将菌液与等体积血液混合后涂片，计算细菌数与红细胞比例。根据比例来计数（4）比浊法测定菌数的快速方法。菌液中细胞浓度与浑浊度成正比，因此测定悬液的光密度就可以反映细胞浓度。将未知细胞数的悬液与已知细胞数悬液相比来计数。2、测定活菌数（1）载玻片薄琼脂层计数法（2）平板菌落计数法（CFU）：取定量稀释液，用涂布或倾注平板的方法在固体培养基上培养，计算菌落（3）液体稀释培养基计数：将待测样品作连续10倍稀释，一直稀释到稀释液的少量接种到新鲜培养基中没有或极少生长。记录每个稀释度出现生长的试管数，再用或然率理论，查MPN（mostprobablenumber，最大可能数量）表，根据样品的稀释倍数就可计算出其中的活菌含量。（4）薄膜计数法：如果测定量大而含菌浓度很低的样品（如空气、水）中的活菌数，可将样品用微孔薄膜（硝化纤维素薄膜）过滤，再与膜一起放到培养基或浸透培养液支持物表面培养。3、计算生长量：测细菌重量（1）测细胞干重：一般干重为湿重的20-25%。收集单位体积培养液中菌体，干燥器内加热或减压干燥，直接用仪器测定。（2）测细胞含N量确定细胞浓度：凯氏定氮法测N，总蛋白含量=含N量%×6.25（3）通过DNA测定计算浓度：荧光法，每个菌平均含DNA8.4×10-5ng（4）生理指标：测定微生物对氧的吸收、发酵糖产酸量或二氧化碳产量。第二节微生物的生存因子一、温度温度对生活机体的影响表现在两方面：一方面是随着温度上升，细胞中生物反应和生长速率加快，另一方面蛋白质、核酸等可能在高温下被破坏。每种微生物都有最低生长温度、最高生长温度、最适生长温度、致死温度。各种微生物最适温度不一致，可将微生物分为嗜冷菌、嗜中温菌、嗜热菌、嗜超热菌。大多数细菌是嗜中温菌。嗜热菌和嗜超热菌是特殊微生物，细分为：专性嗜热菌、兼性嗜热菌、超嗜热菌。微生物类型生长温度／℃最低最适最高嗜冷微生物0以下1520兼性嗜冷微生物020-3035；嗜温微生物15-2020-4545以上嗜热微生物4555-6580超嗜热或嗜高温微生物6580-90100以上1、嗜冷菌专性嗜冷菌：最适5-15℃，最低-12℃，两极地区。兼性嗜冷菌：最适10-20℃，最低，-5-0℃，海水及冷藏食品李斯特菌嗜冷微生物能在低温下生长的机制在于：（1）酶在低温下仍能有效地发挥作用（2）细胞膜中不饱和脂肪酸含量较高，低温下仍能保持流动状态。低温致死的原因是细胞内水分变成冰晶，造成细胞脱水，还造成细胞尤其是细胞膜的损伤。2、嗜热菌：适于在45-50℃中生长，主要分布在温泉、堆肥和土壤中。机制：（1）酶和蛋白质比中温型更能抗热（2）产生多胺、热亚胺和高温精胺，可稳定细胞中与蛋白质合成有关的结构和保护大分子免受高温的损害（3）核酸也有保证热稳定性的结构（4）细胞膜中含有较多的饱和脂肪酸和直链脂肪酸，使膜具有热稳定性（5）生长速率快，合成大分子迅速，可及时弥补由于热所造成的大分子的破坏二、pH环境中的pH对微生物生命活动影响很大：1、引起细胞膜电荷的变化，影响微生物对营养物质的吸收2、影响代谢过程中酶的活性3、改变生长环境中营养物质的可给性及有害物质的毒性不同微生物生长所需的pH不同。大多数微生物最适pH6.5-7.5，适应范围在pH4-10之间。能在pH1-5范围内生长的微生物称为专性嗜酸微生物，如氧化硫硫杆菌、酸热硫化叶菌；能在酸性条件下也能在中性条件下生长的为兼性嗜酸微生物；能在高pH下生长的为嗜碱性微生物，如巴氏芽孢杆菌能在pH11.2-11.6条件下生长（最适pH9.6）。微生物最低pH最适pH最高pH细菌3-56.5-7.58-10酵母菌2-34.5-5.57-8霉菌1-34.5-5.57-8在培养微生物的过程中，随着微生物的生长繁殖和代谢进行，pH会变化：碳源：葡萄糖、乳糖→有机酸——pH下降氮源：蛋白质、蛋白胨、氨基酸→氨、胺类——pH上升（NH4）2SO4→SO42-——pH下降Na2NO3→NO32-被吸收——pH上升尿素→氨——pH上升三、氧化还原电位（Eh）指的是氧化体系供给电子（作为还原剂）或接受电子（作为氧化剂）的趋势的度量，单位为mv。氧化环境有正电位，还原环境有负电位各种微生物需要的氧化还原电位不同：好氧微生物—+300~+400mv，大于100mv才能生长；兼性厌氧微生物—+100mv以上好氧呼吸，小于+100mv无氧呼吸；专性厌氧微生物—–200~-250mv，产甲烷菌-300~-400mv。影响因素：1、氧分压：分压高，氧化还原电位高2、pH：pH低，氧化还原电位低3、微生物的生长：对有机物的氧化可使氧化还原电位下降，在代谢过程所产生的H2、H2S也使氧化还原电位下降。加入还原剂可使氧化还原电位下降。要提高氧化还原电位，提高氧的通气。氧化还原电位影响微生物许多酶的活性，也影响细胞的呼吸作用。在某些条件下，如果保持低的氧化还原电位，则专性厌氧菌可不被氧杀死。所以有人认为氧不是专性厌氧菌的致死原因，而是由于氧所形成的高氧化还原电位。四、溶解氧根据微生物与分子氧的关系，分为：好氧微生物：专性好氧微生物——PO20.2×101KPa微量好氧微生物——PO20.03-0.2×101KPa兼性厌氧（兼性好氧）厌氧微生物：专性厌氧微生物——PO2小于0.005×101KPa耐氧厌氧微生物——（一）好氧微生物与氧的关系大多数细菌、大多数放线菌、霉菌、原生动物、微型后生动物都属于好氧性微生物。氧对好氧微生物的作用：1、作为微生物好氧呼吸中电子传递链的最终受体2、参与甾醇类和不饱和脂肪酸的生物合成在利用氧的过程中，氧可产生各种有毒的代谢产物如过氧化氢、羟自由基、超氧阴离子等，好氧微生物体内具有SOD、CAT、过氧化物酶可清除之。好氧微生物需要的是溶解氧。氧的溶解度与水温、大气压有关。温度低，溶解度大；压力大，溶解度大。在纯水中0℃时氧溶解度14mg/L；10℃——11.3mg/L；20℃——9.2mg/L；30℃——7.7mg/L。含有机物的污水溶解度很低好氧微生物需要供给充足的氧气。实验室内振荡培养，工业生产上采用通入无菌空气和搅拌等方法供氧。污水处理中利用各种充氧设备充氧，供给量根据微生物的数量、理化性质、基质性质及浓度综合考虑。一般来说，溶解氧质量浓度维持在3-4mg/L，若供氧不足，废水处理效果不好。（二）兼性厌氧菌与氧的关系兼性厌氧菌既有脱氧酶