PCR专题讲座

PolymeraseChainReaction聚合酶链反应定义是一种模拟天然DNA复制过程,由引物介导、耐热DNA聚合酶催化，在体外扩增特异DNA片段的一种快速而有效的方法。历史沿革1958Enrmberry分离出DNA多聚酶1976Chien分离出热稳定性多聚酶1985Mullis发明多聚酶链式反应1988复旦大学研制出FD多聚酶1989分子年PCR爆炸年技术特点一、特异性强针对性强二、灵敏度高可达fg级三、简便快速检测周期短四、样品取材要求低所有临床标本基本原理一、生化原理1、变性作用2、复性作用二、操作原理扩增材料一、仪器1、台式高速微量离心机2、PCR热循环仪3、微量塑料离心管4、微量加样器5、电泳仪、电泳槽6、紫外分析仪二、模板DNA扩增体系一、引物二、TaqDNA聚合酶三、标准PCR缓冲液四、底物五、模板核酸操作步骤一、建立扩增体系二、模板提取三、上机扩增四、检测五、报告质量控制避免交叉感染，防止假阳性出现1、实验室管理2、室内控制外源性核酸3、阴、阳性对照临床应用泌尿系列一、淋病双球菌NG二、沙眼衣原体CT三、解脲支原体UU四、人乳头瘤病毒HPV五、单纯疱疹病毒HSV六、梅毒螺旋体TP七、金黄色葡萄球菌SAU肺科系列一、结核杆菌TB二、肺炎支原体MP三、肺炎衣原体CP优生优育一、人类巨细胞病毒HCMV二、弓形虫TOX三、单纯疱疹病毒HSV四、风疹病毒RV五、α—地中海贫血a–THA肝炎系列一、甲型肝炎HAV二、乙型肝炎HBV三、丙型肝炎HCV四、戊型肝炎HEV双链DNA分子单链DNA分子变性复性PCR由高温变性、低温退火和适温延伸反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA片段迅速扩增，扩增产物的量取决于最初靶DNA的数量、PCR扩增率及循环次数。通常反复进行30次循环后，使目的DNA片段成百万倍增加，便可用肉眼从染色的琼脂凝胶中见到清晰的区带。NG由淋病双球菌引起的泌尿生殖器黏膜化脓性炎症，普通培养基不易生长，镜检漏检率高。检测范围：临床可疑患者、孕妇检查、体检等取材：尿道子宫颈拭子血液心包液•脑脊液CT不仅引起眼部感染，而且是性传播疾病的主要病原体，感染常无特异症状。取材：尿道宫颈内膜眼分泌物拭子UU又叫解脲脲原体，常在临床上误为淋病，长期治疗效果不佳。取材：收集宫颈口（女性）棉拭或尿道口（男性）分泌物及前列腺液。HPV检测范围：尖锐湿疣宫颈癌及癌前病变HPV分型取材：分泌物活检组织宫颈刮片HSV检测范围：可疑对象流行病调查病原体分型指导用药孕妇常规检查取材：角膜拭子口腔拭子宫颈拭子TB检测范围：早期诊断鉴别诊断流行病学调查随访取材：痰腹水脑脊液支气管灌洗液脓液尿活检组织MP检测范围：对支原体肺炎、原发性典型性肺炎的确诊取材：收集患者的咽拭子、痰或肺泡灌洗液送检。HCMV标本收集：取患者血液、尿液、唾液、咽拭子、支气管洗液、乳汁等。先于病毒感染的临床症状或免疫学指标的出现。TOX标本收集：收集脑脊液、羊水、脑组织、宫颈、阴道、外阴、阴茎分泌物等。弓形虫可寄生在哺乳类、两栖类、鱼类、爬行类的任何有核组织细胞中，选择性不强。RV标本收集：采集患者、孕妇血液或胎儿羊水、宫颈分泌物、痰液、咽拭子等。只对人致病。预防重点是育龄妇女。HBsAg++--HBsAb---+HBeAg+---HBeAb-+--HBcAb+++-意义急慢性恢复窗口免疫乙肝期期后PCR高度HBVHBVHBV（+）复制复制复制复制PCR无无感染免疫（-）复制恢复后HBsAg-+-HBsAb+--HBeAg---HBeAb+--HBcAb+--意义康复携带者未感染PCR+慢活肝HBV复制感染早期PCR-恢复携带者未感染肿瘤1、鼻咽癌EBV2、幽门螺旋杆菌HP伤寒杆菌其他1、腺病毒Adv2、柯萨奇病毒Cox3、轮状病毒ROV4、狂犬病毒RT5、细小DNA病毒B196、霍乱弧菌VCH荧光定量技术1996年由美国AppliedBiosystems公司推出采用先进的Taqman荧光探针技术，比常规多了一个寡聚核苷酸探针，Taq酶分子在链延长过程中可以通过自身的5，--3，核酸外切酶降解与模板结合的特异性荧光探针。技术特点一、污染最少二、灵敏度更高三、可准确定量四、特异性增强五、定量范围宽六、操作简便七、安全临床意义一、使全程动态观察病毒含量成为可能二、选择治疗时机三、估计治疗反应四、观察药物疗效五、选择治疗方案六、治疗后随访及检测复发七、确定耐药菌株及选择合适的治疗方案八、抗病毒新药的研制