MicroRNA简介

基因。它们就像散落于天幕的星星一样，分散在人类的基因组中。而在这些基因间存在的大片大片的DNA片段是不能编码蛋白质的，即“非编码序列”。由于功能不清，加州理工学院的大野·乾于1972年提出用“垃圾基因”的概念来形容它们。30亿个碱基对组成的DNA序列中，只有1%—2%编码蛋白。，其中的外显子，也就是能够制造蛋白质的编码序列.也就是说，在人类基因组中，有98%的信息是看似无用的“垃圾”。非编码DNA（或称“垃圾DNA”），是指不包含制造蛋白质的指令，或是只能制造出无转译能力RNA的DNA序列。此类DNA在真核生物的基因组中占有大多数。远远超过编码基因，有很长的一段时间科学家们没有认为这些非编码的作用，垃圾”DNA还能通过合成调节性RNA发挥功能。这些RNA并不是为了合成蛋白质，但却在生命的舞台上扮演着不同的角色。迄今为止，细胞中的rRNA、tRNA、snRNA、asRNA、snoRNA、miRNA、piRNA都是非编码“垃圾”DNA合成的。它们参与到基因活化、基因沉默、基因印记、剂量补偿、蛋白合成与功能调节、代谢调控等众多生物学过程中。科学家们已经发现：“垃圾”DNA的功能之一就是调节基因的活动，如同一道指令一样，控制着基因。一些控制基因开和关的特殊蛋白(转录因子)能特异识别基因附近的非编码“垃圾”DNA，通过与它们相互作用参与基因的抑制与激活。科学家还发现，大多数基因的开启和关闭是由附近的“垃圾”DNA控制的。它们就像是基因的“分子”开关，调节基因的活动。例如，在酵母中，大约30%基因上游的非编码DNA在基因调控中发挥作用。在拥有更大基因组的哺乳动物中，虽然特殊的有功能的“垃圾”DNA的分布要比在酵母中分散，但却在编码蛋白序列的上下游区域内呈簇分布。这部分的研究由于与疾病的相关性，因此收到科学家的瞩目。这么少的基因耗费了如此大的基因组是不是太过于浪费啦？那么，在学术界和新闻媒体中广为流传的“基因的墓场”是真的吗？经过漫长岁月的进化，许多“垃圾DNA”序列被顽固地保留下来，这是不是在暗示它们有着不可或缺的功能？“垃圾”DNA对生物意味什么？海量“垃圾”的存在引发了科学家们浓厚的兴趣并重拾对“垃圾”序列的关注，也掀起了一场声势浩大的从垃圾中寻宝的浪潮。“合”指的是合理。亿万年的进化使不合理的基因基本上都被淘汰了，所以存在的基因其功能必定是合理的，至少具有合理性的一面。合理的表现就是能够促进个体的生存和繁衍。合理遵循两个原则：一，经济原则。生物不会浪费物质和能量在一个无用或者冗余的基因上。凡是一个基因可以实现的功能，没有必要用两个基因。二，有效原则。基因的功能应该促进而不是损害生物的生存和繁衍。根据合理性原则，无需任何实验证据，我们不难想到非编码DNA序列是有用的，不是无用的垃圾。该领域中，经过miRNA的大热之后，现在lncRNA也成为该领域的重点研究对象，小伙伴们也可以从越来越多的相关标书中发现倪端。一、RNA分类以上是根据功能来分类，还可根据片段大小来分类SmallncRNA和LongncRNA，SmallncRNA是指片段小于200nt的RNA，除了我们熟悉的MicroRNA和tRNA、rRNA外，还有snoRNA（小核仁RNA）、piRNA（Piwi蛋白互做RNA）等等十多种，也都是各有各的作用。非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA。其中包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA和microRNA等多种已知功能的RNA，还包括未知功能的RNA。这些RNA的共同特点是都能从基因组上转录而来，但是不翻译成蛋白，在RNA水平上就能行使各自的生物学功能了。低等的生物，象病毒、细菌等只有少量的“Junk”DNA，而高等的动、植物则含有大量“Junk”DNA，它们甚至占据着基因组的大部分。这就是说，伴随着生物从简单到复杂、从低级到高级、从信息少到信息多，非编码DNA不断增加。它意味着“Junk”DNA可能蕴涵着生物体复杂性的信息。二、microRNA概述MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，具有在翻译水平或转录后水平调控基因表达的功能.其本身不具有开放阅读框架(ORF)，并且不编码蛋白质。microRNA兴起1993年，Ambros小组以线虫为对象用基因打靶技术研究某些基因对其发育的影响。他们找到了一个对发育有明显干扰的基因。通常线虫要通过四个幼虫阶段才能成熟，这个基因的突变使其只停留在第一阶段。令人们惊奇的是这个基因并不编码任何蛋白质，而是编码一个microRNA。但可以以不完全互补的方式与lin-14基因的mRNA的3‘非翻译端的特定区域相互作用，最终抑制lin-14蛋白质合成，调控着线虫幼虫由L1期向L2期的转化。在线虫中发现了第一个miRNA-lin-4。以后的研究证明，这样的小RNA基因在果蝇、软体动物、鱼类以及人体中都存在。（秀丽隐杆线虫基本的生命周期如下：秀丽隐杆线虫由雌雄同体产下卵。卵在孵化后，会经历四个幼虫期（L1－L4）。当族群拥挤或食物不足时，秀丽隐杆线虫会进入另一种幼虫期，叫做dauer幼虫。Dauer能对抗逆境，而且不会老化。雌雄同体在L4期生产精子、并在成虫期产卵。雄性能使雌雄同体受精；雌雄同体会优先选择雄性的精子。秀丽隐杆线虫在实验室中20°C的情况下，平均寿命约为二、三周，而发育时间只须几天。）2000年以来，大量的miRNA被研究者发现和鉴定。到目前为止，在SangermicroRNA序列数据库(miRBase，21.0版)中含有28645条发夹前体序列，35828条成熟miRNA序列，涵盖了223个物种，这些生物体内担负着重要的调控功能。2000年，Ruvkun实验室又发现另一个miRNA分子let-7，至此miRNA逐渐进入人们的视野，并成为科学界的“明星分子”。let-7与lin-4作用相似，同样可以调节线虫的发育进程。Let-7最早在G.elegans体内发现，长为21nt，存在于线虫的幼虫时期的第三期、第四期以及成虫期，与蜕皮激素相关。Let-7基因的表达决定了线虫从幼虫向成虫的形态转变，抑制let-7RNA活性，将会导致成虫阶段出现幼虫期的形态；而let-7RNA在幼虫期过度表达则会导致早熟。成熟的miRNA具有如下特点：a．高度保守性、时序性和组织特异性，miRNA的表达具有时间特异性和空间特异性；线虫中发现的miRNA有三分之一以上可以在人体细胞内找到同源体。目前发现的大多数miRNA的表达呈现出时序性和组织特异性。有研究发现，lin-4和let-7等一些miRNA呈发育时间特异性表达，lin-4在线虫发育的早期表达，而let-7则在线虫发育的晚期和成虫阶段表达。miRNA表达还具有细胞特异性或组织特异性，Beuivnk,I通过对人体多种组织miRNA表达谱的研究，证实了miRNA的表达具有明显的组织差异性。这个特点提示miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。b．多靶效应，一个miRNA可以靶向多种不同的mRNA。c.基因簇集现象：基因簇（genecluster）是指基因家族中来源相同、结构相似和功能相关的基因在染色体上彼此紧邻所构成的串联重复单位，定于染色体的的特殊区域。miRNA基因并非随机分布，从单一pri-miRNA加工而来的共表达miRNA存在基因簇集现象，miRNA簇集的存在可能与miRNA基因的协同作用有关。例如miR-35～miR-41基因簇集在线虫2号染色体的1kb片段上，并且由同一个pri-miRNA上加工形成7个成熟的miRNA。d.成熟的miRNA5′端有一磷酸基团,3′端为羟基,这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来；根据miRNA基因在基因组中的定位，可将其分为四类：a.位于可编码基因内含子的miRNA，如miR-25～93～106b基因簇位于MCM7的内含子区；b.位于非编码基因内含子的miRNA，如DLEU2内含子中的miR-15a～16-1；c.位于可编码基因外显子的miRNA，如CACNG8中的miR-985；d.位于非编码基因外显子的miRNA，如BIC外显子区的miR-155。总之，miRNA的转录或是独立转录或是与其他ncRNA或mRNA共转录。miRNA基因以单拷贝、多拷贝或者基因簇等形式存在于基因组中，而且绝大部分定位于基因间隔区(intergenicregion，IGR)，也有部分来自于内含子区．三、microRNA合成过程miRNA基因通常是在核内由RNA聚合酶II(polII)转录的，但是，也有一部分miRNA是由RNAPolIII转录产生的。最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的含有几百或几千个核苷酸的pri-miRNA。pri-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的具有茎环结构的pre-miRNA。Pre-miRNA在3端具有2个核苷酸的突出，这一特殊的结构被核转运蛋白Exportin-5所识别，RAN–GTP和exportin5将pre-miRNA输送到细胞质中。随后，另一个核酸酶Dicer及其结合蛋白将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA:miRNA*双链。miRNA双链与细胞质内Ago家族蛋白等结合在一起形成沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC），其中一条成熟的单链miRNA保留在这一复合体中。另一条会迅速被降解。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达。microRNA通过其种子序列(seedregion，5端的2～8位核苷酸序列)与靶mRNA的3端-UTR(有些是5端-UTR或CDS)互补靶序列完全或部分匹配，介导mRNA的降解或翻译抑制。MiRNA首先是由MiRNA的hostgene转录获得的，hostgene转录，形成了primarymicroRNA（pri-MiRNA），然后通过Drosha–Pasha复合体，形成了precursormicroRNA（也就是pre-MiRNA），接着pre-MiRNA被Dicer剪切成双链的RNA，然后双链RNA被AGO1保护起来，其中一条链被降解，另一条链就被保留下来了。被降解的链一般被称之为“Passengerstrand”，这条链一般不容易被检测到，很简单，因为被降解了嘛。这条链也被称之为星号链，一般会表示为“miR-×××*”。另一条链被称之为“Guidestrand”，也就是先导链，这条就是我们通常所说的miRNA。在microRNA形成的过程中，是一个“茎-环”前体把那个“环”结构切除以后就剩下了一个“茎”，而这个“茎”本身呢？又是一个双链结构，因此它的每一个单链都会形成一个成熟的microRNA，也就是说一个microRNA前体最多可以形成两条microRNA的。但是我们知道，表达量的高低不是那么好确定的，除去实验误差不说，往往在一个组织里microRNA有星号的那个表达量很低，到了另一个组织里它就变得高表达了。因此这种命名法实际上是不科学的。此外，2011年开始，有很多文献，开始表明miRNA星号链是有功能的（WidespreadregulatoryactivityofvertebratemicroRNA*species.，Yang，2011），星号链的功能，也有可能比先导链更为高级。那这样用“*”来标记就有点过时了。从miRBase17.0版开始，就对成熟体microRNA的名字进行了改变，规定不管表达量如何，产生自“茎-环”结构5`端那个的就在名字后面加上一个“-5p”，对应地，另一条就是后缀为“-3p”的了。需要特别提出的是，不是每一个“茎-环”结构的microRNA前体都会产生两个成熟体microRNA的，如果只产生一个产物，那它的名字后面就什么也不添加了。五、成熟miRNA调控靶mRNA翻译的机制按其作用模式不同可分为三种：1.二者不完全