显微镜的使用及微生物形态观察

13810实验10.1显微镜的使用及微生物形态观察10.1.1目的要求了解光学显微镜的结构、各部分的功能；掌握光学显微镜的使用、保养方法；观察微生物的形态，学会生物图的绘制。10.1.2器材和材料10.1.2.1仪器或其它用具光学显微镜、镜纸、吸水纸等。10.1.2.2溶剂或试剂⑴镜油：香柏油或石蜡油。⑵镜头清洗液：二甲苯或醚醇清洗液（乙醚70mL，无水乙醇30mL）。10.1.2.3菌种米酒酵母、链霉菌、青霉、曲霉、根霉等装片。10.1.3实验内容10.1.3.1显微镜的基本结构普通光学显微镜由机械和光学两大部分组成，见图10.1。图10.1显微镜构造示意图1.目镜；2.镜筒；3.镜臂；4.标本移动器；5.粗动限位器；6.粗调节器；7.细调节器；8.镜座；9.反光镜；10.虹彩光圈；11.聚光器；12.载物台；13.物镜；14.物镜转换器（引自钱存柔、黄仪秀.微生物学实验教程.北京：北京大学出版社.1999）⑴机械部分镜座是显微镜的基座，使显微镜能平稳地放置在桌子上。镜臂用以支撑镜筒，也是搬动显微镜时手握的部位。镜筒是连接目镜和物镜的金属筒。镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。载物台是放置标本的地方。镜台上有压片夹用以固定被检标本，较好的显微镜则有标本移动器，转动螺旋可使标本前后和左右移动。有的标本移动器带139有游标尺，可定位标本所在位置。物镜转换器安装在镜筒的下端，其上装有3～4个不同放大倍数的物镜，可以通过转动物镜转换器选用合适的物镜。调节器安装在镜臂的基部，是调节物镜与被检标本之间距离的装置，通过转动粗调节器和细调节器便可清晰地观察到标本。⑵光学部分物镜是显微镜中很重要的光学部件。根据物镜的放大倍数和使用方法的不同，分为低倍物镜、高倍物镜和油镜三种，常用的放大倍数为低倍物镜10×、高倍物镜40×、油镜100×。目镜是把接物镜放大的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。通常有5×、10×等规格。聚光器安装在载物台下，能将平行的光线聚焦于标本上，增强照明度。聚光器可以升降，升高时增强光强，下降时减弱光强。虹彩光圈附于聚光器内部，可开大或缩小，以调节进入镜头的光线的强弱。光圈大小应适当，使物像能得到更清晰的效果。反光镜是普通光学显微镜的取光设备，使光线射向聚光镜，分平、凹两面，使用低倍镜和高倍镜均应用平面镜；凹面镜聚光力强，适合于光线较弱时，一般在使用油镜时用凹面镜。内光源是较好的光学显微镜自身带有的照明装置，安装在镜座内部，由强光灯泡发出的光线通过安装在镜座的集光镜射入聚光镜。其强弱可进行调节。10.1.3.2显微镜的使用方法（1）显微镜的取用和放置从显微镜箱或柜内取出显微镜时，应一手提镜臂，另一手托镜座，让显微镜直立，防止目镜从镜筒中脱落。显微镜应直立放置在桌上。离桌缘3cm，检查各部件是否完好，镜身、镜头必须清洁。（2）标本放置下降载物台或升高镜筒，使物镜远离载物台。将低倍镜转至正下方，把标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。（3）低倍镜观察侧面注视，用粗调节器调节上升载物台或下降镜筒，使物镜与玻片接近，距离约0.5cm处，开放光圈，下降聚光器。选用平面反光镜并调节其角度，使视野内光线均匀，亮度适宜。如有内置光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度。再由目镜观察，同时转动粗调节器下降载物台或升高镜筒，使物镜逐渐远离玻片，标本在视野中显现后，再使用细调节器调节至图像清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。（4）高倍镜观察在低倍镜下找到合适的目标并将其移至视野中心后，侧面注视，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至正下方。适当调节聚光器光圈及视野亮度，用细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本，仔细观察并记录所观察到的结果。140在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时，仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。（5）油镜观察使用同焦显微镜时，在高倍镜或低倍镜下找到要观察的区域后，移开镜头，在待观察的区域滴加1～2镜油，将油镜转至油中，调节光强，使视野的亮度合适，用细调节器调节物像清晰为止。对于不等焦的显微镜，用粗调节器下降载物台或升高镜筒，使物镜逐渐远离玻片，在标本观察区滴加镜油，然后将油镜转至镜筒下方，须在侧面注视下，用粗调节器调节上升载物台或下降镜筒，使物镜与玻片接近，将油镜前端浸入镜油中，并几乎与标本相接。将聚光器升到最高位置并开足光圈，调节照明，使视野的亮度合适，用粗调节器上升镜筒或下降载物台，使物镜缓慢离开玻片，直至视野中出现物像，并用细调节器使其清晰准焦为止。有时按上述操作还找不到目的物，则可能是油镜头下降或载物台提升还未到位，或因油镜上升或载物台下降太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。另外应特别注意，不要因在下降镜头时或提升载物台时用力过猛或调焦时误将粗调节器向反方面转动而损坏镜头及载玻片。（6）显微镜用毕后的处理用粗调节器使物镜远离玻片，取下载玻片。用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许镜头清洗液擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的镜头清洗液。切忌用手或其它纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。用擦镜纸清洁其它物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。放平反光镜，把聚光镜降下，将物镜转成“八”字形，将各部分还原，归置镜箱中。10.1.3.4显微镜的维护和保养显微镜是贵重精密的光学仪器，正确的使用、维护与保养，不但观察物体清晰，而且延长显微镜的使用寿命。（1）显微镜应放置在通风干燥，灰尘少，不受阳光直接曝晒的地方。不使用时，用有机玻璃或塑料布防尘罩罩起来。也可套上布罩后放入显微镜箱内或显微镜柜内，并在箱或柜内放置干燥剂。（2）显微镜要避免与酸、碱及易挥发具腐蚀性的化学物品放在一起，以免显微镜受损。（3）显微镜应防止震动和暴力。粗、细调节螺旋、聚光器螺旋和标本移动器等机械部分要灵活而不松动，如不灵活可在滑动部位滴加少许润滑油。（4）显微镜的目镜、物镜、聚光器和反光镜等光学部件必须保持清洁，防止长霉。镜检时通过转动目镜、物镜及调整焦距等措施判断灰尘或污脏所在部位，如附有灰尘，则先用吸耳球吹去灰尘，或用擦镜纸轻轻擦去。若有污脏，用擦镜纸沾镜头清洗液轻轻擦拭，然后用擦镜纸擦干。显微镜的金属油漆部件和塑料部件，可用软布沾中性洗涤剂进行擦拭，不要使用有机溶剂。141（5）用油镜观察后，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后用擦镜纸沾少许镜头清洗液擦拭，最后用干净的擦镜纸擦干。10.1.4实验报告绘出你所观察到的几种微生物形态图思考题1.镜检玻片标本时，为什么要先用低倍物镜观察，而不直接用高倍物镜或油镜观察？2.油镜用毕后，为什么必须把镜油擦净？用过多的清洗液擦镜油有什么危害？3.观察时为什么要用左眼，并且两眼都应睁开？10.2细菌的简单染色法及革兰氏染色法10.2.1目的要求学习并掌握无菌操作技术；学习细菌涂片、染色的基本技术；掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法；巩固显微镜（油镜）的使用方法和学习生物绘图技术。10.2.2染色原理细菌个体微小，菌体透明，必需通过染色使其着色后，才能较好地在光学显微镜下观察其个体形态和部分结构。10.2.2.1简单染色法利用细菌在中性环境中带负电荷，而碱性染料如结晶紫、美蓝、碱性复红、番红等解离后带正电荷，细菌与染料具有亲和力而被着色的原理，采用一种单色染料对细菌进行染色，称为简单染色法。适用于菌体一般形态的观察。10.2.2.2革兰氏染色是细菌学中的一个重要的鉴别染色法。由于应用了结晶紫和番红两种不同性质的染料进行染色，故又叫复染色法。根据细菌对此种染色法的反应不同，可将细菌分为两大类，菌体呈者为革兰氏阳性菌，呈红色者为革兰氏阴性菌。其原因是由于这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，交联度大，类脂质含量低，经用乙醇（或丙硐）脱色等处理主要发生脱水作用，而使孔经缩小，通透性降低，初染剂结晶紫和媒染剂碘的复合物保留在细胞内不被脱色，结果使细胞呈紫色；而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，类脂含量高，当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙硐）溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫和碘的复合物较容易被洗脱出来，用番红复染后，细胞被染上红色。10.2.3实验材料和用具10.2.3.1菌种大肠杆菌、白色（或金黄色）葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（培养18～24h的斜面菌种）。应用新鲜幼龄的菌体进行涂片。10.2.3.2试剂及染液（1）齐氏石炭酸复红染液：A液：碱性复红0.3g，95%乙醇10mL142B液：石炭酸5.0g，蒸馏水95mL将A、B二液混合摇匀过滤。（2）草酸铵结晶紫染液：A液：结晶紫2.0g，95%乙醇20mLB液：草酸铵0.8g，蒸馏水80mL将A、B二液充分溶解后混合静置24h过滤使用。（3）鲁哥氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL配制时，先将碘化钾溶于5~10mL水中，再加入碘1g，使其溶解后，加水至300mL。（4）95％乙醇（5）番红染液：2.5%番红的乙醇溶液10mL，蒸馏水100mL混合过滤。10.2.3.3器材无菌水、显微镜、擦镜纸、吸水纸、载玻片、接种环、酒精灯、石蜡油、镜头清洗液。10.2.4实验内容及步骤10.2.4.1简单染色法操作步骤如下：(1)制片涂菌取洁净载玻片一块将其一面在火焰上微微加热，除去油脂，冷却，在载玻片中央滴加一小滴无菌水，用烧灼冷却后的接种环从试管中取少许菌和玻片上的水滴混匀，涂布成一均匀的薄层即可。无菌操作过程见图10-2。接种环用后必须再次烧灼灭菌。干燥涂布后，待其在空气中自然晾干。固定将已干燥的涂片正面朝上，通过火焰３次，以热而不烫手为宜。固定的作用是杀死细菌；可使蛋白质凝固，并使细菌粘附在玻片上，染色时不被染液或水冲掉；增加菌体对染料的结合力，使涂片易着色。143图10.2无菌操作过程及涂片过程1–烧灼接种环；2–拔去棉塞；3–试管口灭菌；4–挑取小量菌体；5–试管口灭菌；6–将棉塞塞好；7–做涂片；8–烧去残留的菌体（引自顾夏声等.水处理微生物学.北京：中国建筑工业出版社.1998）（2）染色在涂片处滴加1～2滴染色液（石炭酸复红、草酸铵结晶紫或番红任选一种），使其铺满涂菌的部位，染色约1min。（3）水洗斜置载玻片，倾去染液，用细水流轻轻冲去多余染料，直至流水变清为止。注意水流不得直接冲在涂菌处，以免将菌体冲掉。（4）吸干用吸水纸轻轻吸去载玻片上的水珠，自然干燥。（5）镜检将干燥后的染色标本，先用低倍镜找到目的物，将低倍镜移开，滴加石蜡油于涂片处，用油镜进行观察。注意各种细菌的形态和细胞排列方式。用铅笔绘出细菌形态图。观察完毕，用擦镜纸将镜头上的石蜡油擦净。10.2.4.2革兰氏染色法步骤（1）制片以无菌操作技术取大肠杆菌和枯草杆菌（或白色葡萄球菌）分别做涂片、干燥、固定。方法与简单染色相同。还可在同一载玻片上，将两种菌作混合涂片，按下述方法染色后，在镜检时便于比较。（2）染色初染用草酸铵结晶紫染液覆盖1min，用水冲洗。媒染用鲁哥氏碘液冲去残水，并且碘液覆盖1min后水洗。脱色用滤纸吸去玻片上的残水，乙醇滴加在涂片上静置30S立即水洗。或斜置载玻片，用滴管从玻片上端滴加95％乙醇，直至流出的乙醇刚刚不现紫色立即水洗。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇脱色的程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。复染滴加番红复染1min后水洗并干燥。（3）镜检干燥后用油镜观察时应选择薄而均匀的区域，注意染色后细菌的颜色，以单个菌体的颜色为准。菌体被染成紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。绘出镜检细菌的形态，并注明革兰氏染色的结果。若研究工作中要确定未知菌的革兰氏反应时，则需同时用已知菌进行染色