8章细胞重组和克隆技术20120326

细胞重组与克隆技术第一节细胞重组一、胞质杂种二、微细胞核移植三、细胞核移植四、细胞重建细胞拆合：把完整细胞的细胞核与细胞质用特殊的方法分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来，或用紫外线等把细胞中的核杀死，然后再把同种或异种的细胞核和细胞质重新组合起来，培育新的细胞或新的生物个体。细胞重组：细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，在融合介质作用下，使胞质体与完整细胞合并，重新构成胞质杂种细胞的过程。一、胞质杂种胞质体（cytoplast）：除去细胞核后由膜包裹的无核细胞，由细胞松弛素B处理后，经离心得到。如1972年，Prescott借助细胞松弛素和高速离心得到核体（karyoplast）：由胞质体分离出来的核，带有少量胞质并围有质膜的结构。胞质杂种细胞：将胞质体和另一完整细胞融合得到的细胞。杂种细胞：核体与完整细胞融合。重组细胞：核体与另一种细胞的胞质体融合。利用细胞融合技术得到的重组细胞1,2,3亲本细胞4,6核体5,7胞质体8,9杂种细胞10重组细胞11胞质杂种细胞ⅠPEG介导ⅡHAT培养基筛选微细胞：只有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。利用秋水仙素先将细胞阻断在染色体中期，然后培养，再用细胞松弛素B处理得到。以微细胞作供体，通过与遗传性完整的受体细胞融合，可以将微细胞内所含有的几条染色体转移到受体细胞中去。二、微细胞核移植微细胞杂种细胞的制作过程三、细胞核移植核移植起始于用微吸管对阿米巴等原生动物进行的核操作。在1952年，美国人罗伯特·布里格斯和T·J·金，首先利用两栖类卵细胞建立细胞核移植技术。由于两栖类的蛙卵数量较多，体积较大，容易获得，操作方便。1958—1962年，英国剑桥大学的约翰·格登教授和麦金尼尔利用瓜蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲瓜蟾。非洲爪蟾制作我国的研究中国的细胞核移植技术工作，开始于本世纪50年代，主要是在两栖类和鱼类上进行的，从1961年开始，童第周等以金鱼和鳑鲏鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂交细胞核于纯种细胞核在发育功能上的差异，以及细胞质对细胞核的影响。1978年，将黑斑蛙成体红细胞的细胞核移入去核的未受精卵内，卵子最后发育成正常的蝌蚪。哺乳动物核移植哺乳类的移核实验必须在一种很精密的仪器－显微操作仪下才能进行。最早用来做移核试验的哺乳动物是小鼠。1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室用“亚无性繁殖”的方式，培育出7只单亲小鼠。1981年1月，美国《科学》杂志封面刊登3只小鼠的照片，他们将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，经培养移核卵发育至囊胚期，再将胚胎植入同步孕鼠的子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育的个体。核移植小鼠四、细胞重建细胞重建的概念是我国贝时璋院士提出的。定义：体内已经存在的某种物质，可以由细胞质，甚至细胞外的某种基质为基地，通过自组织、自装配过程，一步步地形成完整的细胞。早在20世纪30年代，贝教授在一种甲壳类动物—南京丰年虫的二倍体雌虫卵母细胞中首次发现了细胞重建的现象。细胞重建的发现，证明细胞分裂不是细胞繁殖的唯一途径，它可能是现代生物体内对地球细胞起源的反映，是简单的生命形态进化为细胞的漫长过程的一个缩影，有助于对生命进化过程的阐述。第二节克隆技术一、克隆的定义和理论基础二、克隆技术的发展概况三、克隆的技术方法四、克隆技术的意义及应用五、正确看待克隆技术六、克隆技术的设想1、克隆的定义“克隆”是从英文“clone”音译而来，它是利用细胞工程技术通过动物或植物的一个细胞而发育成的一个完整的个体。该个体并非是供体动物（体细胞提供者）的后代而是它的拷贝——即复制品。一克隆的定义和理论基础多细胞生物体的每一个体细胞的细胞核内均还有发育成该生物体完整个体的所有遗传信息（染色体基因组），也就是说多细胞生物体的每一个体细胞都具有发育成完整个体的潜能，这就是细胞的全能性，也是克隆的理论基础。2、克隆的理论基础理论依据：克隆技术所依赖的理论基础是细胞潜在全能性学说，是指细胞包含个体的全套遗传信息，并在特定环境因素的调节下，可回到受精卵一样的状态，并从头开始发育成一个完整的生物个体。只有具备全能性的动物组织细胞，才可用作克隆动物。高等动物的大部分细胞核完整地保存着源于卵子和精子细胞核的全套遗传信息。3、动物克隆的相关理论基础理论基础—在动物的发育过程中，具有全能性的受精卵需要不断分裂形成分化细胞。在细胞分化过程中，细胞核全能性的潜能不断得到限制。尽管核内的DNA序列没有发生任何变化，但是基因在特定的细胞内所表达的蛋白质成分是有限的。这主要是因为染色体组织改变和稳定阻遏核蛋白复合体阻遏以及相应转录激活的结果。这就是发育生物学中的渐成调控机制。对于发育来讲，这种阻遏作用是必要的。体细胞克隆的成功，意味着卵子或卵母细胞逆转这种阻遏的过程,解除核组织的阻遏状态，使其恢复多能性，甚至全能性。二克隆技术的发展概况1997年2月24日,英国罗斯林研究所试验成功的克隆羊多利，是首次利用体细胞克隆成功的，它在生物工程史上揭开了新的一页。1998年7月22日：科学家采用一种新克隆技术，用成年鼠的体细胞成功地培育出了三代共50多只克隆鼠，这是人类第一次用克隆动物克隆出克隆动物。2000年3月14日：曾参与克隆小羊多莉的英国PPL公司宣布，他们成功地培育出5只克隆猪，这是人类首次培育出克隆猪。2001年1月，美国克隆猴成功，这只恒河猴被命名为“泰特拉”，这意味着克隆人已不存在技术障碍。2002年3月30日法国农业研究所的科学家在《自然生物技术》杂志上发表研究报告，宣布首批克隆兔已经诞生。2002年3月,美国科学家克隆成功猫.2002年10月中国农业大学采用胚胎冷冻技术获得的3头体细胞克隆牛。2003年5月29日华盛顿消息，爱达荷大学的研究人员日前成功的在世界上首次克隆成功出一头被命名为“爱达荷宝石”的骡子，这项成果发表在《科学》杂志上。骡子是母马与公驴的杂交物种，这也是人类第一次成功克隆杂交物种。2003年8月6日，意大利科学家，克雷莫纳市繁殖技术与家畜饲养实验室克隆马科研小组负责人切萨雷·加利博士宣布，世界上第一匹克隆马诞生。这是继克隆骡子出世之后克隆技术的又一大突破，也是世界上首例哺乳动物生下它自己的克隆体。中国克隆出世界著名医用小型猪已成功存活9天2007年06月03日06:42来源：新华网中国成功克隆出的首批两只欧洲哥廷根医用小型猪，在天津宝迪祖代种猪场已成功地存活了9天。据科研人员介绍，这两头克隆小型猪生长发育良好，体况活泼健康。出生重量分别为0.55公斤和0.6公斤，现在已长到1.9公斤和2.3公斤。据介绍，欧洲哥廷根小型猪因其器官大小、结构和生理特点等与人的器官极为相似，已经成为国际上最理想的异种器官移植研究材料。目前，欧洲哥廷根小型猪作为糖尿病、心脏病、高血压、帕金森氏症等重大人类疾病的动物模型和新药筛选模型，得到了全世界医药管理机构的认可。这项研究还首次在国际上成功实现了同一移植受体内进行不同品种和不同类型克隆胚胎的混合移植。三克隆的技术方法克隆主要是指以细胞核移植为核心技术的无性繁殖操作技术。1、细胞核移植细胞核移植是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。细胞核连续移植可以产生无限个遗传相同的个体。细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。用紫外光照射受精卵，破坏原来的细胞核；取得另一个细胞的细胞核；再用极细的玻璃针，重新将新的细胞核植入卵中。其中破坏卵细胞核的目的是为了避免当细胞融合后，不会因为存有多余的染色体而影响细胞正常的生长及分裂。细胞核移植技术要点2、克隆动物的一般制备技术克隆可以通过不同来源的细胞核移植来实现，如胚胎细胞、干细胞、成纤维细胞、体细胞等。其中以胚胎细胞克隆的应用比较普遍，以体细胞克隆的意义最大。胚胎细胞核移植法将未着床的早期胚胎分散成单个的细胞球，在电流的作用下，使这些单个细胞与去除染色体的未受精的卵细胞融合。克隆动物制备的一般过程：核供体动物的选择与细胞核的获得→核受体动物的选择与细胞核的移出→供体核的移入及原核的取出→胚泡的体外试管培养→代母的选择与胚泡移入子宫→克隆动物的体内发育与出生胚胎干细胞核移植胚胎干（EmbryonicStem,ES）细胞是早期胚胎细胞或囊胚ICM细胞经抑制分化后培养而筛选出来的一类全能性细胞，这种细胞具有正常的二倍体核型，它既可以在特定条件下进行无限增殖而不发生分化，又可以在特定条件下分化为包括生殖系在内的各种细胞和组织。ES细胞具有体外发育的全能性，并且可以在体外无限传代，因此，它是动物克隆的理想供体细胞。ES细胞作为核移植供体细胞与体细胞的制备方法类似，亦需进行细胞周期的调控。迄今为止，只有在小鼠和人已培养建立ES系，而牛、兔、羊、猪仅获得了拟干细胞，因此用真正的ES细胞进行核移植只有小鼠是获得了成功。胎儿成纤维细胞核移植胎儿成纤维细胞核移植是指从妊娠早期胎儿分离出胎儿成纤维细胞，采用细胞核移植方法克隆出胚胎，经移植受体后，克隆出动物个体。体细胞核移植技术体细胞克隆技术是将动物体细胞经过抑制培养，使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，发育成胚胎后移植至受体，妊娠产仔，克隆出成体动物。用体细胞克隆出哺乳动物，是由英国科学家维尔穆特开创的。而“多莉”是世界上第一例用体细胞──乳腺上皮细胞，通过细胞核移植技术，在复杂的人工操作下，得到的一只小绵羊。英国科学家维尔穆特（Wilmut）与多莉（Dolly）“多莉”克隆的操作过程：1）从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；2）从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；3）利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；4）将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。细胞核的移核过程克隆技术的科学意义和潜在的经济效益十分巨大。1、克隆动物实验成功是生物学上一个重大贡献。它证明哺乳动物体细胞也有全能性；分化了的体细胞遗传信息没有丢失，而是基因表达调控的改变，不是不可逆的。2、有助于对细胞周期和生物生长发育机理的研究，揭示发育早期卵细胞细胞质对细胞核基因信息的表达有重要调节作用，对生命科学基础理论问题的探究有重要的意义。四克隆技术的意义及应用3、有助于建立医学动物模型，生产生物活性药物，提供人体所需的内脏器官，用于器官移植或替换体内衰老及发生病变的器官。4、它能克服动物种间杂交繁殖障碍，培育良种，在优秀种公、母畜的纯种快速繁育扩群方面具有重大开发价值。5、加快珍稀动物繁殖，使异种动物借腹妊娠、产仔，保护和抢救濒危动物。四克隆技术的意义及应用克隆技术的应用随着体细胞克隆技术的发展，它与人类生产和生活的关系也就愈发密切，不同研究领域的科研人员都提出了克隆技术在不同领域的应用前景。1、体细胞克隆技术用于动物遗传资源保存由于人口增加和社会经济的发展,动物遗传资源处在空前的危险之中。美国国土、渔业和野生生物局(USFW)在1998年公布了濒临灭绝的哺乳动物名单,其中包括美国本土动物59种,国外动物251种。家养的动物品种也是遗传多样性的重要组成部分，随着经济的发展,一些地方品种灭绝的速度实际上比动物物种更快。我国有上千种畜禽品种,它们都各具特殊优点,如果任由它们自行灭绝,将是一种不可弥补的损失。然而,保存这些品种在技术上和经济上都有很