AMP活化蛋白激酶在终板软骨细胞体外传代培养中的表达及意义

中国组织工程研究第20卷第29期2016–07–08出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchJuly8,2016Vol.20,No.29ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4297·研究原著·赵泉来，男，1986年生，安徽省当涂县人，2013年皖南医学院毕业，硕士，医师，主要从事脊柱外科临床及基础研究。通讯作者：徐宏光，博士，主任医师，教授，硕士生导师，皖南医学院第一附属医院弋矶山医院脊柱外科，安徽省芜湖市241001中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)29-04297-06稿件接受：2016-04-29AMP活化蛋白激酶在终板软骨细胞体外传代培养中的表达及意义赵泉来，郑权，徐宏光，沈祥，王弘，刘平，王凌挺，杨晓明，陈学武，张玙，李逸峰，俞宏星(皖南医学院第一附属医院弋矶山医院脊柱外科，安徽省芜湖市241001)引用本文：赵泉来，郑权，徐宏光，沈祥，王弘，刘平，王凌挺，杨晓明，陈学武，张玙，李逸峰，俞宏星.AMP活化蛋白激酶在终板软骨细胞体外传代培养中的表达及意义[J].中国组织工程研究，2016，20(29):4297-4302.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.006ORCID:0000-0002-5619-8082(赵泉来)文章快速阅读：文题释义：终板软骨：终板软骨为附着于椎体上下缘的一层透明软骨，它能够将椎体末端血管中的营养物质通过渗透作用运输至髓核和内层纤维环，是椎间盘主要的营养途径，终板营养途径阻断，可致椎间盘内Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等表达减少，椎间盘发生退变。AMP活化蛋白激酶：AMP活化蛋白激酶(AMPK)是真核生物中一种重要的蛋白激酶，其在各种与代谢相关的器官中均有表达，能够协调调节细胞的合成代谢和分解代谢，因此被称为细胞能量调节器，近年的研究表明AMP活化蛋白激酶活性与软骨的形成和降解也有重要的关系。摘要背景：终板软骨功能障碍是椎间盘退变的始动因素，AMPK在软骨的形成和降解过程中也具有相应的调节作用。目的：观察AMP活化蛋白激酶(AMPK)在终板软骨细胞体外自然传代退变模型中的作用。方法：分离大鼠腰椎终板软骨细胞，体外自然传代培养，取原代细胞(P0)、第2代细胞(P2)及第5代细胞(P5)，倒置显微镜及细胞骨架染色观察终板软骨细胞形态的变化，甲苯胺蓝染色观察终板软骨细胞表型的改变；MTT法检测3组细胞的增殖能力；通过Realtime-PCR评价3组终板软骨细胞中软骨标志基因(Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9)以及基质金属蛋白酶3和13的表达变化，Westernblot检测终板软骨细胞中AMPK蛋白磷酸化的改变。结果与结论：①随着传代次数的增加终板软骨细胞形态发生改变，增殖能力降低，软骨细胞表型逐渐丢失；②P5代终板软骨细胞中Ⅱ型胶原、蛋白聚糖及SOX-9基因表达明显下调(P0.05或0.01)，而基质金属蛋白酶3,基质金属蛋白酶13基因表达较P0代及P2代均明显增高(P0.01)；③Westernblot结果显示P5代终板软骨细胞中AMPK蛋白磷酸化水平明显降低。提示：AMPK磷酸化的水平与终板软骨细胞体外自然传代过程中软骨细胞的退变密切相关，调控AMPK活性有可能减轻或阻止终板软骨及椎间盘的退变。关键词：组织构建；软骨细胞；椎间盘；终板软骨细胞；传代培养；AMPK；国家自然科学基金主题词：椎间盘；软骨细胞；基质金属蛋白酶类；组织工程AMP活化蛋白激酶在终板软骨细胞体外传代培养中的表达与变化终板软骨细胞形态变化Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9表达AMPK、基质金属蛋白酶3和13表达大鼠终板软骨细胞苏木精-伊红染色、倒置相差显微镜原代终板软骨细胞5代终板软骨细胞2代终板软骨细胞RT-PCR免疫印迹赵泉来，等.AMP活化蛋白激酶在终板软骨细胞体外传代培养中的表达及意义P.O.Box10002,Shenyang110180基金资助：国家自然科学基金(81272048)；卫生部公益性行业专项基金(201002018)；安徽省自然科学基金(1308085MH152)ExpressionofAMP-activatedproteinkinaseinsubculturedratendplatechondrocytesZhaoQuan-lai,ZhengQuan,XuHong-guang,ShenXiang,WangHong,LiuPing,WangLing-ting,YangXiao-ming,ChenXue-wu,ZhangYu,LiYi-feng,YuHong-xing(DepartmentofSpineSurgery,YijishanHosptial,WannanMedicalCollege,Wuhu241001,AnhuiProvince,China)AbstractBACKGROUND:Endplatecartilagedegenerationinitiatesintervertebraldiscdegeneration.AMP-activatedproteinkinase(AMPK)regulatestheformationanddegradationofcartilage.OBJECTIVE:ToexploretheroleofAMPKinaninvitronaturaldegenerationmodelofchondrocytesderivedfromendplateofratintervertebraldiscs.METHODS:Morphologyofinvitrosubculturedendplatechondrocytesofratintervertebraldiscsatpassages0,2,and5wereobservedunderaninvertedmicroscopefollowingcytoskeletonstaining.Chondrocytephenotype,proliferation,andthecartilagemarkergenes(typeIIcollagen,proteoglycan,SOX-9,matrixmetalloproteinase-3and-13),andAMPKphosphorylationweredeterminedbytoluidinebluestaining,MTTassay,real-timePCRanalysis,andwesternblotassay,respectively.RESULTSANDCONCLUSION:Thealteredmorphology,decreasedproliferationability,andphenotypelosswereobservedinchondrocyteswithincreasedpassagenumber.GeneexpressionoftypeIIcollagen,proteoglycan,SOX-9wassignificantlydecreased;whilegeneexpressionofmatrixmetalloproteinase-3and-13wassignificantlyincreasedinendplatechondrocytesatpassage5comparedwiththoseatpassages0and2.AMPKphosphorylationinendplatechondrocytesatpassage5wassignificantlydecreased.ThesefindingsindicatethatAMPKphosphorylationisinvolvedininvitronaturaldegenerationofchondrocytesderivedfromtheendplateofratintervertebraldiscs,andthedegenerationofendplatechondrocytesandintervertebraldiscscanbeinhibitedthroughtheregulationofAMPKactivity.Subjectheadings:IntervertebralDisk;Chondrocytes;MatrixMetalloproteinasesFunding:theNationalNaturalScienceFoundationofChina,No.81272048;SpecialFundofthePublicServiceoftheMnistryofHealthofChina,No.201002018;theNaturalScienceFoundationofAnhuiProvince,China,No.1308085MH152Citethisarticle:ZhaoQL,ZhengQ,XuHG,ShenX,WangH,LiuP,WangLT,YangXM,ChenXW,ZhangY,LiYF,YuHX.ExpressionofAMP-activatedproteinkinaseinsubculturedratendplatechondrocytes.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(29):4297-4302.0引言Introduction椎间盘退变作为最常见的脊柱退行性病变，是引起腰背痛的重要因素之一。终板软骨是位于椎体两端的薄层透明软骨，是椎间盘营养供应的主要途径，同时在椎体与椎间盘之间的力学传递中也具有重要的作用[1]。众多的研究表明在椎间盘退变的早期终板软骨的形态就已经发生明显的改变，终板软骨表型的丢失是导致椎间盘退变的始动因素[2-3]。AMP活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase，AMPK)是真核生物中一种重要的蛋白激酶，在各种与代谢相关的器官中均有表达，它能够协调调节细胞的合成代谢和分解代谢[4]，因此被称为细胞能量调节器。AMPK不仅能控制能量代谢同时还能够调节与蛋白合成及线粒体生物合成相关的生物学途径[5]。此外，AMPK在软骨的形成和降解过程中也具有相应的调节作用，其活性与关节软骨的退变密切相关[6]，然而其在椎间盘及终板软骨退变中的作用目前尚不清楚。因此，实验通过观察大鼠腰椎终板软骨细胞体外传代过程中软骨合成基因、代谢基因以及AMPK蛋白的表达变化，初步探讨AMPK与终板软骨退变的关系。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计分组对照细胞学实验。1.2时间及地点实验于2014年11月至2015年10月在皖南医学院第一附属医院中心实验室完成。1.3材料1.3.1实验动物清洁级SD大鼠10只(6周龄)，体质量(160±20)g，雌雄不限(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，合格证号：SCXK(沪)2014-0034。赵泉来，等.AMP活化蛋白激酶在终板软骨细胞体外传代培养中的表达及意义ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4299培养液(Hyclone,美国)；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶(Sigma．Aldrich，美国)；胎牛血清(Gibico，美国)；Trizol裂解液(Invitrogen，美国)；Nano-Drop2000(Thermo&Scientific，美国)；PCR反应体系和反转录试剂盒(Fermentas，美国