ARTP诱变筛选匍枝根霉提高木聚糖酶活力研究

ARTP诱变筛选匍枝根霉提高木聚糖酶活力研究摘要:以TP-02匍枝根霉亚种点头根霉为出发菌株，利用ARTP诱变系统进行诱变处理，通过透明圈法进行初筛和摇瓶发酵进行复筛，获得一株遗传性状稳定的高产木聚糖酶菌株TZD-01，木聚糖酶活力达到280.81U/ml,为原始菌株的2.7倍。再用电子显微镜和扫描电镜观察诱变筛选后菌株与原始菌株微结构特征变化，ARTP诱变处理匍枝根霉可引起菌株形态特征发生改变，突变株的菌落形态不规则，颜色为黑褐色比原始菌株偏深，菌丝直径变大，形态更饱满和孢子形态规则更接近圆形，诱变筛选菌株的生长速度比原始菌株快。关键词:ARTP；匍枝根霉；木聚糖酶；扫描电子显微镜Abstract:ToTP-02RhizopusstolonifersubspeciesnodRhizopusasstartingstrain,wasmutagenizedusingARTPmutagenesissystem,throughthetransparentcirclemethodofsieveandshakeflaskfermentationwererescreened,astrainofgeneticallystablehighyieldofwoodofgettingxylanasestrainTZD-01,woodpolyenzymeactivityreached280.81U/ml,was2.7timesashighastheoriginalstrain.Mutagenesisscreeningstrainandoriginalstrainmicrostructuralchangesintheobservedusingelectronmicroscopyandscanningelectronmicroscopy(SEM),ARTPmutagenesistreatmentinduceschangesinthemorphologyofstraincharacteristicsofRhizopusstolonifer,irregularmorphologyofcoloniesofthemutation,colorisdarkbrownthantheoriginalstraindarker,bacteriawirediameterbecomeslarger,fullermorphologyandsporemorphologyrulesclosertoround,mutagenesisandscreeningofthestraingrowthratethanthatoftheoriginalstrain.木聚糖是一种多聚五糖，广泛存在于植物界中，是构成植物细胞壁中半纤维素多糖的主要成分[1]。木聚糖酶[2-3]主要由β－1,4－D－外切木糖苷酶和β－1,4－D－内切木聚糖酶构成，是能降解木聚糖为木糖和木寡糖的一组酶的总称。在微生物、动物和植物中均可获得木聚糖酶,其中木聚糖酶主要是从微生物发酵产物中提取[4],近年来报道曲霉、海枣曲霉、青霉、木霉、裂褶菌、芽孢杆菌等均能产生木聚糖酶[5]。在食品、生物漂白、生物制浆、饲料和处理造纸厂废水的环境污染等方面木聚糖酶应用前景广阔[6-7]。常压室温等离子体（atmosphericandroomtemperatureplasma，ARTP）诱变系统是由清华大学与北京思清源公司合作研发而成，利用发射粒子丰富且均匀的等离子体射流，使粒子穿过细胞膜对遗传物质发生作用，导致遗传物质的多样性损伤，由于DNA不完全修复进而形成突变株[8]；ARTP诱变系统优点有无需真空装置、产生的等离子体均匀、操作简易、射流温度低、与生物大分子和细胞作用明显、成本低等[9]，已成为微生物快速诱变的有效方法。本实验以TP-02匍枝根霉亚种点头根霉为出发菌株，该菌株具有生长周期短，不易染菌等特点。利用ARTP技术对该匍枝根霉进行诱变处理,诱变条件为通气量10L/min、功率100W、等离子体发射源与样品之间距离为2mm，处理时间为240s。经过筛选得到一株遗传性状稳定的高产木聚糖酶菌株,确定一种匍枝根霉诱变筛选的方法，用电子显微镜和扫描电镜观察诱变筛选后菌体与原始菌株微结构特征变化。1材料与方法1.1菌株与试剂菌株：匍枝根霉亚种点头根霉（Rhizopusstolonifervar．reflexusTP-02）,从黄山生态林腐木上分离得到；其他试剂均为国药分析纯。1.2主要试验设备与仪器常温室压ARTP诱变育种机，北京思清源生物科技有限公司与清华大学联合开发；采用日本日立S-4800扫描电子显微镜(SEM)。1.3培养基固体斜面培养基（PDA）:葡萄糖20g，琼脂20g，马铃薯200g，水1L，自然pH;用于菌种保存和传代培养。初筛平板培养基(g/L):K2HPO42.0,NH4NO32.0,MgSO4·7H2O0.2，酵母膏5.0,木聚糖20.0,琼脂20.0,pH7.2,此培养基用于菌种的透明圈测定[10]；复筛培养基:10%麦麸浸出汁，PH自然；复筛扩大培养基：麦麸2%，玉米芯2%，（NH4）2SO40.3%，KH2PO40.2%,MgSO4·7H2O0.2%,CaCl20.4%,吐温－800.05%,PH自然。1.4方法1.4.1孢子悬浮液的制备:在无菌操作台中用无菌水从斜面上洗下孢子，经过棉花、漏斗进行过滤,在滤液中加入玻璃珠，摇床震荡2小时后,将梯度稀释后的孢子悬浮液分别滴到血球计数板上，在显微镜下进行计数，将孢子浓度调整到106-107个/mL。1.4.2ARTP诱变方法:以1.4.1方法调整孢子悬浮液浓度，按照ARTP诱变系统的操作流程，以氦气作为工作气体，诱变条件为通气量10L/min、功率100W、等离子体发射源与样品之间距离为2mm[11]。诱变主要的可变因素是处理时间,为了获得适宜的诱变时间，分别设定0s,，60s，120s，180s,，240s，270s，300s，330s，360s为处理时间。诱变处理后放置于装有1ml生理盐水的EP管中后培养，振荡器上震荡1min形成新的菌悬液，再进行梯度稀释，取100ul稀释液涂布平板，30℃培养计数菌落数。1.4.3筛选方法:（1）初筛：将经过ARTP诱变后的孢子悬浮液进行适当稀释后，涂布于含有木聚糖的筛选培养基上,30℃培养到长出菌落后，用刚果红进行染色。测定菌落周围透明圈直径(H)与菌落直径(D)之比,以H/D比值来初步判定诱变后菌株产木聚糖酶的能力大小，然后挑选出比值较大菌落进行纯化并保存[12]。（2）复筛：将初筛所得菌株接入复筛培养基中,30℃,180r/min,培养24h；再转接入复筛扩大培养基中,接种量10%，30℃，180r/min，培养5d后测定酶活。1.4.4木聚糖酶活力测定:木聚糖酶活力的测定采用DNS法[13]。将发酵液在4℃、8000r/min的离心管中离心10min，离心后取上清液作为粗酶液。520nm处测定其吸光度，酶活力定义：在50℃、PH4.6下，每分钟分解木聚糖产生1umol木糖所需的木聚糖酶量为1个单位酶活力（U）。活力计算公式：VTMXU310其中M为木糖摩尔质量，T为反应时间，X为木糖含量，V为酶液体积实验用DNS法测吸光值时，保持测得的吸光值在0.2-0.8之间。1.4.5匍枝根霉产木聚糖酶遗传稳定性实验选育出高产突变株后,对其遗传稳定性进行了研究,进行了10次传代培养,并分别测定木聚糖酶活性。1.4.6电子显微镜和扫描电镜检测诱变前后菌体形态取相同条件下培养的匍枝根霉诱变菌株和原始菌株平板进行试验，从平板上用接种环分别刮下少许匍枝根霉的菌丝，用乳酸石炭酸棉蓝染色，染色后进行制片，电子显微镜下观察菌体形态；从平板上用接种环分别刮下少许匍枝根霉的菌丝，置于滴有无菌水的盖玻片，进行固定，将固定好的菌体样品置于样品台上，用离子镀膜仪进行喷金，再用扫描电镜进行观察。1.4.7突变菌株与原始菌株发酵对比以原始菌株作为对照，将诱变筛选的突变菌株进行发酵实验，在相同条件下进行培养，每天测定酶活并进行发酵对比。2结果与分析2.1ARTP诱变致死率曲线的测定按照方法1.4.2进行ARTP诱变致死率曲线的测定，利用CFU计算菌株的致死率，绘制出致死率曲线[14]，结果如图1所示。致死率公式:致死率=(U－T)/U×100%注:U为诱变前生长的菌落数，T为诱变后生长的菌落数图1ARTP处理的匍枝根霉TP-02致死率曲线由图1可知，随处理时间的延长ARTP对匍枝根霉TP-02菌株的致死率明显增加，诱变处理180s时，致死率超过85%，诱变处理240s时，致死率达到93%，当诱变处理时间为360s时，致死率趋近100%。据文献报道，当致死率在90%左右时，诱变处理对细胞的诱变效应较强[15]。所以本实验采用240s处理时间（致死率93%）对匍枝根霉TP-02菌株进行诱变。2.2ARTP诱变匍枝根霉产木聚糖酶菌株的筛选结果2.2.1初筛按照1.4.3初筛的方法进行实验，测定菌落周围透明圈直径(H)与菌落直径(D)之比，得到32株比值相对较大的菌株，结果如表1所示。表1初筛结果编号12345678910111213141516H/D1.11.20.91.21.40.81.71.30.81.01.61.31.61.11.00.9编号17181920212223242526272829303132H/D1.31.51.11.51.20.91.40.81.61.21.01.30.91.51.31.82.2.2复筛如图2所示出发菌株匍枝根霉TP-02经ARTP诱变处理，初筛出H/D比值较大的32株菌株进行复筛，每组摇瓶做三个平行实验，取酶活平均值，突变菌株酶活与原始菌株酶活之比，即为，大于1为正突变，小于1为负突变，获得5株（编号为10、17、24、27、30）相对突变比值的突变菌株，分别命名为TZD-1、TZD-2、TZD-3、TZD-4、TZD-5。图2突变菌株与原始菌株相对突变比值2.3遗传稳定性实验如图3所示对获得的5株突变菌株，进行连续10次传代培养，每代进行发酵实验并测定木聚糖酶活力，原始菌株作为对照组，获得一株遗传稳定的诱变菌株，该菌株命名为TZD-01。图3突变菌株遗传稳定性实验2.4ARTP诱变处理前后匍枝根霉形态观察研究2.4.1ARTP诱变处理引起匍枝根霉菌落形态、色泽变化如图4所示左边图a为诱变后菌株TZD-01平板菌落形态，右边图b为相同条件下原始菌株菌落形态，诱变后的菌株菌落形态不规则，椭圆形菌落数量比原始菌株少，菌落直径比原始菌株大，色泽偏黑褐色，48h已经形成较多褐色的孢子，说明诱变后菌株生长速度加快。图4诱变前后菌落形态2.4.2400倍电子显微镜下观察诱变前后匍枝根霉孢子囊形态变化图5400倍电子显微镜下匍枝根霉诱变前后孢子囊形态匍枝根霉形成孢子囊，囊內细胞质分裂形成多数孢子，孢子成熟后变为黑褐色，为橢圆形，当孢子囊壁破裂时，孢子即散出，图c和图e为诱变后菌株孢子囊，图d和图f为相同条件下原始菌株孢子囊，从形态上观察，孢子囊均为椭圆形，呈多核状态，诱变后菌株孢子囊更偏圆形，生长速度比原始菌株快，24h孢子囊已成熟，孢子变为黑褐色，开始有孢子散出。2.4.3扫描电镜下观察匍枝根霉菌体诱变前后形态变化图6扫描电镜下匍枝根霉菌体诱变前后形态匍枝根霉特征是具有细长菌丝，不分隔，菌丝初期为白色，后转为灰色或褐色，图A、C、D、F、H为诱变后菌株扫描电镜图片，图B、E、G、I为原始菌株扫描电镜图片，由图A、B可知，菌丝粗细均匀，形态饱满，笔直，直径约6～15µm，诱变后菌株菌丝直径稍大，孢子大多为椭圆形，稍有凹陷，直径约2~4µm，诱变后菌株菌丝附着孢子数量明显比原始菌株多，形态更接近椭圆，说明诱变后菌株生长更快，孢子发育更好；由图C、D、E可以清楚观察到孢子囊的形态为椭圆形，含有大量孢子，图C比图E的孢子囊发育要成熟，已经开始有大量孢子散出，孢子囊周围出现许多散开的孢子，图D比图E的孢子囊更偏向椭圆，周围散落的孢