99mtc标记促凋亡蛋白smac多肽进行肿瘤显像的基础研究

摘要：肿瘤的发生是细胞增殖与细胞凋亡失衡所致,凋亡抑制蛋白（IAP）是一类内源性caspases家族抑制因子,其过度表达引起的凋亡不足与肿瘤发生,治疗耐药密切相关。线粒体促凋亡蛋白Smac可通过其N端的4个氨基酸与多种IAP特异性结合，解除IAP的抑制作用。因此基于肿瘤高表达IAP,Smac多肽可特异性结合IAP这一特性，借助NHS-MAG3双功能螯合剂，99mTc标记融合细胞穿透序列的Smac6肽，进行肿瘤显像，量化IAP表达，比较肿瘤治疗前后肿瘤摄取显像剂的差异，评估肿瘤治疗疗效。该方法的建立，不仅可丰富核医学肿瘤显像方法，还可将此多肽用治疗性核素如188Re标记，以凋亡抑制蛋白为靶点进行肿瘤核素内放射治疗，具有极大的研究前景关键词：凋亡抑制蛋白；促凋亡蛋白Smac；多肽标记；肿瘤核素显像报告正文一立项依据与研究内容㈠立项依据细胞凋亡是受基因调控的细胞自主死亡的过程，是一系列凋亡相关分子及其正、负调节分子相互作用的结果，这一过程对消除机体内老化细胞及具有潜在异常生长的细胞,保持机体处于稳态起着重要的作用。凋亡中,caspases家族即半胱天冬酶家族具有重要地位。caspases按其在凋亡过程中的功能分为启动酶和效应酶。启动酶包括caspase2,8,9,10；效应酶包括caspase3,6,7。效应酶通过切断细胞间的信号传递,重组细胞骨架,关闭DNA复制和修复,破坏DNA和细胞核结构,诱导凋亡小体形成来执行凋亡功能[1]。caspases家族以无活性的前体形式存在,该前体需经级联性的蛋白水解作用而被激活。而凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins,IAPs)是caspases家族的内源性抑制因子，其成员包括XIAP,c-IAP1,c-IAP2,Survivin,Livin,NAIP,Apollen/Bruce,ILP2。该家族成员均含有1～3个杆状病毒IAP重复序列(baculoviralinhibitorofapoptosisrepeats,BIR)，利用此结构区与caspase3,7,9结合而发挥凋亡抑制作用。比如XIAP含有3个BIR结构区，其中BIR1,2连接区抑制caspase3,7，BIR3特异性地抑制caspase9。Livin含有一个BIR区，可特异性抑制caspase9;Survivin也通过其BIR区直接抑制caspase3,7[2,3]。同样，IAPs抗凋亡的能力也受到调节。线粒体促凋亡蛋白Smac(secondmitochondrialactivatorofcaspase)/DIABLO(directIAPbindingproteinwithlowpI)可与多种IAPs包括XIAP,c-IAP1,c-IAP2,survivin,livin的BIR区特异性结合，解除IAP的抑制作用,释放活化的caspases。Smac，25kDa大小，前体存在于正常细胞线粒体,在凋亡信号刺激下,其N端55个氨基酸被剪切，形成成熟的Smac释放到细胞质而发挥作用[4]。X线晶体衍射成像显示成熟的Smac通过N端前4个氨基酸：丙氨酸－缬氨酸－脯氨酸－异亮氨酸（AVPI）与IAP家族的BIR结构域表面凹槽结合，从而解除对caspase的抑制，发挥促凋亡作用[5]。（图1：caspases，IAP和Smac相互作用关系示意图，图2：Smac解除IAP抑制caspase作用示意图）利用此特性，Arnt等分别将成熟Smac氨基端的4个氨基酸（AVPI）、6个氨基酸(AVPIAQ)、8个氨基酸(AVPIAQKS)与果蝇触角转录因子穿透序列（RQIKIWFQNRRMKWKK）相连接，合成可穿透细胞的融合多肽，与一些上皮来源的肿瘤细胞如乳腺癌细胞株MCF-7,T47D孵育，通过免疫共沉淀的方法证实各种融合多肽的确能穿透细胞膜，与内源性的XIAP,cIAP1结合，并能提高化疗药物如依托泊苷、紫杉醇诱发的凋亡，其中Smac6肽能力最强[6]。Vucic等也合成了含有果蝇触角转录因子穿透序列Smac9肽（AVPIAQKSE），利用极化荧光分析技术证实Smac9肽不仅可以和XIAP的BIR3区结合，同样也可和Livin的BIR区结合[7]。Sun等利用核磁共振分光法证实Smac多肽也可类似结合XIAP与survivn结合[8]。IAP家族成员在多种人类恶性肿瘤中表达明显增高，以Survivin,XIAP，c-IAP1,c-IAP2,Livin为著。如肺癌（85.5％）、胰腺癌（88％）、食道癌（70%）、结肠癌（53%）、乳腺癌（60％）、结肠癌（53.2％）、膀胱癌（58％）和胃癌（68％）表达survivin，且其表达与肿瘤的恶性程度和预后显著相关[9-12]。在恶性黑色素瘤、肺癌、胃癌、膀胱癌、绒毛膜癌中有Livin表达，尤其在恶性黑色素瘤组织中的阳性率可达47.6%~70.6%，明显高于黑色素细胞痣（21.4~25.0%）[13]。XIAP也在白血病、肝癌、肺癌、子宫颈癌等多种恶性肿瘤中表达增高。本课题负责人所在之研究小组利用组织芯片及免疫组化技术对1100余例人类肿瘤中IAP家族成员的表达情况进行分析，也得到了相似结果。肿瘤治疗过程中,许多抗肿瘤药物及放疗均是通过启动细胞凋亡机制完成的,而凋亡过程的抑制常常导致肿瘤细胞耐药[14]。IAP在肿瘤细胞中过表达是肿瘤细胞逃避免疫监督的主要原因,IAP基因表达增高,细胞凋亡受抑,导致肿瘤耐药。如Kato等的研究表明,食道癌Survivin的高表达能够对抗抗癌药引起的凋亡,在化疗效果好的患者的肿瘤组织中Survivin表达水平明显低于化疗效果差的患者,提示Survivin表达量能够预测肿瘤对化疗的反应[12]。Li等检测了卵巢癌细胞中XIAP的表达情况,发现耐药细胞株XIAP的表达水平明显强于对化疗药物敏感细胞株,敏感细胞株经顺铂处理后,XIAP的表达下降,凋亡指数上升,而对耐药细胞株,顺铂未能影响XIAP的水平及细胞凋亡[15]。因此，定量分析IAP表达对评估肿瘤的恶性程度、预后及治疗反应有极大的帮助。大多数肿瘤高表达IAP，Smac多肽可特异性结合IAP。多肽具有组织渗透迅速、血液中清除快、免疫原性低和合成方便的特性。因此,若用某些可被探测的物质如放射性同位素标记该多肽，注射入体内，采用SPECT或PET则可进行肿瘤显像，同时还可以进行定量分析，量化IAP的表达，为临床医生评估肿瘤的恶性程度及预后，制定疾病的治疗方案提供重要的帮助，同时还可为治疗药物的筛选提供有力的帮助。99mTc是目前运用广泛的纯γ核素，具有优良的理化性质，能标记多种化合物，在核医学临床诊断和实验研究中得到了广泛的运用。巯基乙酰三甘氨酰-N-羟基丁二酰亚胺酯(NHS-MAG3)作为一种有效的双功能螯合剂,在90年代中后期被用于人多克隆免疫球蛋白、抗体、小分子肽、DNA寡核苷酸及肽核酸等的99mTc标记[16]。通过NHS-MAG3得到的标记产物,血浆蛋白结合率低,特别适合小分子物质的标记。因此本研究选择NHS-MAG3作为螯合剂，对融合了穿透序列的成熟Smac氨基端的前6个氨基酸AVPIAQ-RQIKIWFQNRRMKWKK进行99mTc标记,探讨用于肿瘤诊断，预后以及肿瘤耐药评价的可行性。试图通过基于凋亡抑制基因进行的显像，扩展肿瘤核素显像方法，为临床评估肿瘤预后、治疗疗效提供有用信息。如该方法的确可行，还可对其进行188Re标记，以凋亡抑制蛋白为靶点进行肿瘤核素内放射治疗，具有极大的研究前景。图1凋亡信号传导通路示意图（Fuentes-PriorP，2004）图2Smac/DIABLO解除IAP蛋白抑制caspase作用示意图（VerhagenAM，2001）acaspase9通过其P10亚单位与XIAP的BIR3结构域凹槽紧密结合bcapase3的催化部位同BIR2上游的连接体区结合（capase7也类似）cSmac/DIABLON端氨基酸与caspase9类似，可竞争性结合BIR3凹槽，解除IAP对caspase9的抑制dSmac/DIABLO可与BIR2上游的连接体区结合，解除对caspase3，7抑制参考文献1:JacobsonMD,WeilM,RaffMC,etal.Programmedcelldeathinanimaldevelopment.Cell.1997;88(3):347-54..2:VerhagenAM,CoulsonEJ,VauxDL.Inhibitorofapoptosisproteinsandtheirrelatives:IAPsandotherBIRPs.GenomeBiol.2001;2(7):REVIEWS3009.3:ShiY.Mechanismsofcaspaseactivationandinhibitionduringapoptosis.MolCell.2002;9(3):459-70.4:DuC,FangM,LiY,etal.Smac,amitochondrialproteinthatpromotescytochromec-dependentcaspaseactivationbyeliminatingIAPinhibition.Cell.2000;102(1):33-42.5:WuG,ChaiJ,SuberTL,etal.StructuralbasisofIAPrecognitionbySmac/DIABLO.Nature.2000;408(6815):1008-12.6:ArntCR,ChioreanMV,HeldebrantMP,etal.SyntheticSmac/DIABLOpeptidesenhancetheeffectsofchemotherapeuticagentsbybindingXIAPandcIAP1insitu.JBiolChem.2002;277(46):44236-43.7:VucicD,DeshayesK,AckerlyH,etal.SMACnegativelyregulatestheanti-apoptoticactivityofmelanomainhibitorofapoptosis(ML-IAP).JBiolChem.2002;277(14):12275-9.8:SunC,NettesheimD,LiuZ,etal.SolutionstructureofhumansurvivinanditsbindinginterfacewithSmac/Diablo.Biochemistry.2005;44(1):11-7.9:KennedySM,O'DriscollL,PurcellR,etal.Prognosticimportanceofsurvivininbreastcancer.BrJCancer.2003;88(7):1077-83.10:SarelaAI,VerbekeCS,RamsdaleJ,etal.Expressionofsurvivin,anovelinhibitorofapoptosisandcellcycleregulatoryprotein,inpancreaticadenocarcinoma.BrJCancer.2002;86(6):886-92.11:KuJH,KwakC,LeeHS,etal.Expressionofsurvivin,anovelinhibitorofapoptosis,insuperficialtransitionalcellcarcinomaofthebladder.JUrol.2004;171(2Pt1):631-5.12:KatoJ,KuwabaraY,MitaniM,etal.Expressionofsurvivininesophagealcancer:correlationwiththeprognosisandresponsetochemotherapy.IntJCancer.2001;95(2):92-5.13:GongJ,ChenN,ZhouQ