ABORhD血型定型检测试剂卡操作指南

输血相容性检测培训课件ABO/RhD血型定型检测试剂卡操作指南【试验目的和原理】ABO血型鉴定是通过检测被检者红细胞上是否存在A和/或B抗原（正定型）以及被检者血浆中是否存在抗A和/或抗B抗体（反定型）来确定。对于成年个体被检者，红细胞上的A和/或B抗原与血浆中的抗A和/或抗B抗体存在一种对应关系。其独特性质在于：红细胞上缺乏A和/或B抗原，则血清中存在与所缺乏的抗原对应的强反应性抗体，如红细胞上缺乏A抗原，则可以预见血浆中存在抗A抗体。常规的ABO定型必须包括正定型（红细胞定型）和反定型（血浆定型），并将正反定型结果相互验证，只有正反定型结果一致时才能准确定型。Rh阳性和阴性的鉴定是通过检测被检者的红细胞上是否有D抗原，有D抗原为Rh阳性，没有D抗原则为Rh阴性。ABO/RhD血型定型检测试剂卡采用凝胶作为微柱凝胶卡的填充物，将生物化学的凝胶分子筛过滤技术、离心技术和血型血清学的抗体特异性结合在一起，其中抗A凝胶管中灌注了含抗A抗体的凝胶，抗B凝胶管中灌注了含抗B抗体的凝胶，抗D凝胶管中灌注了含IgM抗D抗体的凝胶。A细胞、B细胞及Ctr管中灌注了不含血型抗体的凝胶，抗A、抗B及抗D凝胶管用于红细胞上A、B及D抗原检测，而A细胞、B细胞及Ctr管用于检测血浆中的抗体。当抗原抗体反应时，凝集的红细胞在离心力的作用下不能通过凝胶而留在凝胶上层或游离在凝胶中，呈现阳性反应；而抗原抗体没有反应时，未凝集的红细胞在离心力的作用下可通过凝胶而沉积在微柱凝胶管的底部，呈现阴性反应。【ABO/RhD血型定型检测试剂卡的用途】1、用于输血前检测（1）鉴定ABO，以备选择ABO血型相配合的血液用于交叉配血。（2）鉴定RhD血型，以备选择RhD血型相配合的血液用于交叉配血。2、用于围产期检查（1）用于产前夫妇的ABO、RhD血型检测，进行新生儿溶血病产前预测。（2）用于产后母子的ABO、RhD血型检测，进行新生儿溶血病产后诊断。3、用于常规ABO、RhD血型化验检查，如健康体检等。【样本要求】1、建议使用抗凝的血样，尤其是EDTA抗凝管采集的血样，需要量2ml。（EDTA抗凝采血管为紫帽管）。2、血液样本在采集后48小时以内检测。【所需仪器设备及耗材】1、Rh血型分型卡（含抗C、抗c、抗D、抗E、抗e及自身阴性对照）2、血型血清学离心机（用于离心分离血浆、洗涤红细胞）3、微柱凝胶卡离心机4、微量移液枪及吸头【试验操作】按照下列步骤进行操作一、被检血液样本的处理及反定型A型、B型红细胞的准备步骤操作1EDTA抗凝的血液样本离心（900-1000g）1分钟，将上清血浆转入一支1275-mm试管中，余下的压积红细胞备用。如果血浆有不溶物（如混入的红细胞）或不澄清透明，则需要将血浆再次离心，直到澄清透明不含不溶物为止。2另取一支1275-mm试管中，加入0.1ml上述步骤1中的压积红细胞，用生理盐水洗涤一次，弃上清，得到压积红细胞。3在一支1275-mm试管中，加入1ml生理盐水（或Liss液），加入步骤2中得到的压积红细胞10微升，混匀得到0.8-1%浓度的被检红细胞。4将反定型A及B红细胞用生理盐水调节到0.8-1%浓度。二、ABO、RhD定型步骤操作1取ABO/RhD血型定型检测试剂卡一片，注意检查外观，确保凝胶管的凝胶上层存在液面，凝胶不会干枯。将符合要求的卡进行标记，按照试验需要撕开封口膜。2用微量移液枪分别向抗A、抗B、抗D孔及Ctr孔的每孔样品槽中沿样品槽内壁呈45°角缓慢加入50微升0.8-1%浓度的被检者红细胞。3向A细胞孔中加入50微升0.8-1%浓度的A型红细胞。4向B细胞孔中加入50微升0.8-1%浓度的B型红细胞。5分别向A细胞、B细胞、Ctr孔中加入25微升被检者血浆。6在台面交替轻叩卡左下角和右下角，确保所加入的液体在卡的样品槽中呈水平状态，而不是偏向一侧。7将卡放入微柱凝胶卡离心机离心，LB-3000低速离心机第一档离心5分钟，判读结果并记录。【结果判读及解释】1、反应阴、阳性的判读反应图反应强度4+3+2+1+双群阴性红细胞分布凝集红细胞在凝胶顶部表面，呈线条形凝集红细胞开始进入凝胶，但集中在凝胶顶部及上半部分凝集红细胞进入凝胶内部的中下部分凝集红细胞集中在凝胶下半部分，且向底部集中离心后凝集的红细胞位于凝胶顶部；而阴性红细胞集中在微管底部所有红细胞通过凝胶，沉积在微孔底部必须注意：如果红细胞发生凝集，预期其凝集强度≥2+;如果反应弱于2+则需要进一步试验才能准确定型。2、阴阳性结果解释-A-B-DAcBcctr管结果≥2+0≥2+0≥2+0A型D阳性0≥2+≥2+≥2+00B型D阳性00≥2+≥2+≥2+0O型D阳性≥2+≥2+≥2+000AB型D阳性≥2+000≥2+0A型D阴性0≥2+0≥2+00B型D阴性000≥2+≥2+0O型D阴性≥2+≥2+0000AB型D阴性【注意事项】1.血液样本建议是抗凝的样本，尤其是EDTA抗凝的样本，以避免红细胞凝集块加入凝胶引起假阳性反应。2.按照临床输血技术规范，血液样本在采集后应该在48小时内进行检测。3.凝胶卡在使用前需仔细检查，若凝胶卡封口开裂、孔中凝胶干涸、凝胶中有气泡时，不可使用。4.撕开凝胶卡封口膜时，不宜用力过猛，以免造成凝胶微孔间的交叉污染。5.被检的红细胞悬液的浓度为0.8～1%，浓度过高或过低会影响检测结果。6.溶血、脂血、细菌污染等情况的样本可影响检测结果。7.被检红细胞在配制成0.8-1%浓度前必须洗涤1次，保证充分去除血浆成分，且没有纤维蛋白不溶物，否则会阻击红细胞在微柱凝胶中的沉降，呈现假阳性反应。8.在Ctr孔（自身阴性对照）孔结果为阳性时，试验结果无效。可能原因是由于被检红细胞已经致敏IgM抗体导致自发凝集，此时可以用DTT将已经致敏到红细胞上的IgM抗体破坏后再行Rh分型试验。9.人源血液样本存在潜在的传染性，凝胶卡使用后按医疗生物垃圾废弃物处理。10.抗D凝胶不能鉴定弱D、部分D（如DⅥ）抗原。对于患者，如果抗D凝胶管中患者的红细胞反应为阴性，则确定为RhD阴性。11.若出现＜2+的弱阳性反应，须做进一步试验才能准确定型，即确认弱反应是由于被检者的抗原减弱还是凝胶微孔之间的交叉污染引起。12.若出现混合视野反应，需要了解被检者近期3个月内是否有输血史，或被检者是否为骨髓移植患者。13.由于6月龄以下的婴儿其血浆/血清中不似成人一样存在可预见的抗A/抗B抗体，因此只做正定型不做反定型。【ABO正反定型不一致原因分析】如果血型定型正反定型结果不一致时，则不能准确定型，需要分析产生不一致的原因。引起正反定型不一致的原因如下：（一）正定型出现弱反应或缺失抗原１.Ａ亚型、Ｂ亚型或ＡＢ亚型。２.白血病导致Ａ或Ｂ抗原减弱。３.何杰金病（Hodgkin’s）有时会抑制抗原表达，与白血病类似。４.由于某种疾病（如腹腔癌、胰腺癌）导致血浆中存在大量的型物质，中和抗－Ａ或抗－Ｂ抗体，引起正定型为假阴性或弱阳性。需要将正定型的红细胞用生理盐水洗涤后再次定型可解决此问题。５.骨髓移植６.非ABO同型输血（二）正定型红细胞上多余的抗原反应１.自身凝集红细胞、抗体致敏红细胞导致。２.细胞未洗涤，血浆蛋白引起的假阳性反应。３.细胞未洗涤，血浆中存在针对正定型试剂中某种成分的抗体导致。４.骨髓移植。５.获得性B。６.B(A)现象。７.ABO非相合输注。（三）正定型出现混合视野反应１.近期输血２.骨髓移植３.异卵双胞胎或双受精卵产生的嵌合体。４.胎儿和母体出血。（四）反定型血清中出现弱反应或反应缺失１.年龄相关：新生儿以及小于6月龄的婴儿以及老年人。２.ABO亚型有亚型抗体，如A2、A2B型人的抗A1。３.低球蛋白血症（如白血病人、使用免疫抑制剂患者、免疫缺陷患者）。４.移植患者使用抗排异药物。５.双胞胎或双受精卵产生的嵌合体。（五）反定型出现多余的抗体反应１.冷自身抗体２.特异性冷同种抗体３.血清中存在针对试剂红细胞保存液成分的抗体。４.某些疾病导致球蛋白水平增高（多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、Hodgkin’s淋巴瘤）引起缗钱状凝集。５.输用大分子血浆扩容剂。６.非ABO同型的移植７.静脉注射免疫球蛋白。（六）技术方面的错误１.血液样本被污染，如混入其他人样本。２.被检红细胞的浓度过高或过低。３.忘记在反应体系中加入检测样本或试剂。４.未按照试剂使用说明进行试验。５.离心步骤离心时间不足或离心时间超时。６.对试验结果记录或判读不正确。