CARM1维持羊水干细胞干性的机制

中国组织工程研究第20卷第36期2016–09–02出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchSeptember2,2016Vol.20,No.36P.O.Box10002,Shenyang110180·研究原著·吴静，女，1985年生，吉林省扶余县人，汉族，2011年华东师范大学毕业，硕士，实习研究员，主要从事表观遗传和干细胞研究。中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)36-05412-07稿件接受：2016-07-05CARM1WTH3R17mH3R17mH3R17mOCT4H3R17mSOX2CARM1KDH3R17mH3R17mH3R17mOCT4H3R17mSOX2组蛋白修饰pluripotencypluripotency组蛋白修饰CARM1CARM1WTH3R17mH3R17mH3R17mOCT4H3R17mSOX2CARM1KDH3R17mH3R17mH3R17mOCT4H3R17mSOX2CARM1CARM1KDH3R17mH3R17mH3R17mOCT4H3R17mSOX2组蛋白修饰pluripotencypluripotency组蛋白修饰CARM1维持羊水干细胞干性的机制吴静1，赵利华2(上海市儿童医院，上海交通大学附属儿童医院，1中心实验室，2骨科，上海市200040)引用本文：吴静，赵利华.CARM1维持羊水干细胞干性的机制[J].中国组织工程研究，2016，20(36):5412-5418.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.014ORCID:0000-0003-0647-8980(吴静)文章快速阅读：文题释义：羊水干细胞：羊水细胞是由多种来源细胞组成的异质细胞群，包括来源于胎儿表皮、呼吸道、消化道和泌尿道等体腔、管道的脱落细胞和羊膜脱落细胞。近年来研究发现，羊水中含有具多向分化潜能的干细胞，称之为羊水干细胞。目前对于羊水干细胞的自身特征和分子机制的研究非常有限，制约了其向临床应用的进一步转化。CARM1：作为一种蛋白精氨酸甲基转移酶，CARM1可催化一系列组蛋白和非组蛋白精氨酸残基的甲基化修饰，进而影响一系列生物功能的发生。甲基转移酶活性在调控基因转录过程中起着非常重要的作用。据报道，CARM1介导的组蛋白H3R17和H3R26的精氨酸甲基化修饰，在胚胎干细胞干性的维持上起着非常重要的作用。然而，CARM1在其他成体干细胞，尤其是羊水干细胞干性维持中的作用机制目前仍然不甚明了。摘要背景：研究表明，CARM1催化的组蛋白H3R17/R26的甲基化修饰对于胚胎干细胞干性的维持起着非常重要的作用，但其在羊水干细胞干性维持中的作用及机制目前尚不明确。目的：初步探讨CARM1在维持羊水干细胞干性中的作用及其分子机制。方法：分离、培养人妊娠晚期羊水干细胞，RT-PCR鉴定干细胞标志物及CARM1基因的表达。利用CARM1的两条shRNA慢病毒表达载体，沉默羊水干细胞中CARM1基因的表达。RT-qPCR检测CARM1基因的表达沉默效率，Westernblot检测组蛋白H3R17的甲基化水平。RT-qPCR检测干细胞标志物OCT4，SOX2和NANOG基因的表达水平。结果与结论：①人妊娠晚期羊水干细胞能够表达干细胞标志物，包括OCT4、SOX2、Nanog和KLF4，并表达CARM1基因；②CARM1的两条shRNA均能够有效沉默CARM1基因的表达；③CARM1表达沉默后，羊水干细胞中组蛋白H3R17的甲基化水平降低，OCT4和SOX2的表达也降低，而NANOG的表达没有发生变化；④结果表明，CARM1可能通过调控OCT4和SOX2基因的表达，进而起到维持羊水干细胞干性的作用。关键词：干细胞；分化；羊水干细胞；妊娠晚期；CARM1；慢病毒；shRNA；表达沉默；OCT4；SOX2；H3R17甲基化；干性；国家自然科学基金主题词：干细胞；羊水；妊娠末期；蛋白质精氨酸N-甲基转移酶；慢病毒感染；甲基化；组织工程基金资助：上海市卫生局青年科研项目(20124y0700)；国家自然科学基金青年项目(81401763)CARM1促进OCT4和SOX2基因表达维持羊水干细胞的干性吴静，等.CARM1维持羊水干细胞干性的机制ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH5413’sHospitalofShanghai,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200040,ChinaCARM1isrequiredtomaintainstemnessofamnioticfluid-derivedstemcellsWuJing1,ZhaoLi-hua2(1CentralLaboratory,2DepartmentofOrthopedics,Children’sHospitalofShanghai,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200040,China)AbstractBACKGROUND:StudieshaveshownthatmethylationmodificationusingCARM1-catalyzedhistoneH3R17/R26canmaintainthestemnessofembryonicstemcells.However,mechanismunderlyingCARM1effectonthestemnessofamnioticfluid-derivedstemcellsisstillunclear.OBJECTIVE:ToinvestigatethefunctionandunderlyingmolecularmechanismofCARM1tomaintainstemnessintheamnioticfluid-derivedstemcells.METHODS:Amnioticfluid-derivedstemcellsfromtermpregnancywereisolatedandcultured.RT-PCRwasusedtoidentifythestemcellmarkandCARM1geneexpression.CARM1expressioninamnioticfluid-derivedstemcellswasknockeddownbyusingtwoshRNA.RT-qPCRwasusedtodetectthesilencingefficiency,andwesternblotemployedtoexaminethemethylationlevelofArginines17atNterminusofhistone3(H3mR17).Moreover,theexpressionofembryonicstemcellmarkers,includingOCT4,SOX2andNANOG,weredetected.RESULTSANDCONCLUSION:Amnioticfluid-derivedstemcellsfromtermpregnancycouldexpressCARM1andstemcellmarkers,includingOCT4,SOX2,NanogandKLF4.BothoftheshRNAscouldknockdowntheexpressionofCARM1efficiently.WhenCARM1wasknockeddown,theH3mR17levelwasdecreasedandOCT4,SOX2expressionwasalsoreduced,butNANOGexpressionhadnochange.AlltheseindicatethatCARM1isrequiredforamnioticfluid-derivedstemcellstomaintainstemnessthroughregulatingOCT4andSOX2expression.Subjectheadings:StemCells;AmnioticFluid;PregnancyTrimester,Third;Protein-ArginineN-Methyltransferases;LentivirusInfections;Methylation;TissueEngineeringFunding:theYoungScientificResearchProjectofShanghaiHealthDepartment,No.20124y0700;theNationalNaturalScienceFoundationofChina,No.81401763Citethisarticle:WuJ,ZhaoLH.CARM1isrequiredtomaintainstemnessofamnioticfluid-derivedstemcells.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(36):5412-5418.0引言Introduction近年来发现羊水中含有干细胞，并命名为羊水干细胞(amnioticfluid-derivedstemcell，AFSC)[1-3]。羊水干细胞具有获取方便、增殖速度快、分化潜能大以及无体内致瘤性等优点，在细胞治疗和组织工程研究中具有广阔的应用前景[3-6]。目前很多研究都已证明羊水干细胞具有干细胞的特性，即具有自我复制能力和多向分化潜能，但其干性维持的分子机制目前尚未被阐明，其自身一些特征和特性也不清楚，从而限制了向临床应用的转化。事实上，在胚胎干细胞中的研究已经表明，表观遗传修饰，例如DNA的甲基化和组蛋白修饰等，在胚胎干细胞干性维持方面，起到了非常重要的作用，改变细胞的表观遗传修饰，能够改变胚胎干细胞的分化潜能[7-9]。目前羊水干细胞表观遗传修饰在维持其干性方面的作用及分子机制仍然不甚明了。CARM1即共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1(coactivitor-associatedargininemethyltransferase1，CARM1)，也称蛋白精氨酸甲基转移酶4(proteinarginemethyltransferase4,PRMT4)，属于蛋白精氨酸甲基转移酶家族中的蛋白成员，可催化细胞内组蛋白及非组蛋白精氨酸残基的甲基化修饰。作为一种转录共激活因子，CARM1主要催化组蛋白H3第17号位(R17)和26号位(R26)精氨酸的甲基化修饰，促进基因的转录激活[10]。研究表明，CARM1介导的组蛋白H3R17和H3R26的甲基化修饰，作为一种重要的表观遗传修饰，在胚胎干细胞干性的维持上起着非常重要的作用[7，9，11-12]。然而，CARM1在维持羊水干细胞干性中的作用及其分子机制犹未可知。实验初步探讨了CARM1在羊水干细胞干性维持中的作用及其分子机制，旨在帮助研究者更深入了解羊水干细胞的特性，为今后其在细胞治疗及组织工程方面的广泛应用提供坚实的理论基础和技术支持。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计细胞学基础实验研究。1.2时间及地点实验于2013年1月至2015年2月在上海市儿童医院中心实验室完成。吴静，等.CARM1维持羊水干细胞干性的机制P.O.Box10002,Shenyang110180周正常剖宫产产妇，于剖宫产术时抽取羊水标本20-50mL。标本取样前经产妇知情同意。研究获上海交通大学附属上海市儿童医院伦理委员会批准。1.3.2质粒和细胞人胚胎干细胞、pGIPZ-GFP-CARM1-shRNA、ps