Bs8093菌株的鉴定及其对青枯雷尔氏菌的致弱作用

Bs-8093菌株的鉴定及其对青枯雷尔氏菌的致弱作用周先治1，2，张青文2，林营志1，朱育菁1，蓝江林1，刘波1*（1.福建省农业科学院生物技术研究所，福州350003；2.中国农业大学农学与生物技术学院，北京100094）摘要：通过形态特征、生理生化特征、脂肪酸分析和16SrDNA序列分析分离于番茄田土壤中分离的Bs-8093菌株进行了鉴定。结果表明，该菌株为球形芽孢杆菌，最适宜生长温度为30-35℃。研究发现，Bs-8093菌株对17株强致病力青枯雷尔氏菌的致弱能力不同，聚类分析将17株菌分为3类，第一类不易致弱菌株，包括菌株Rs-T.1.3-010702-01、Rs-T.1.3-010702-25、Rs-T.1.3-010702-27和Rs-E.1.3-010719-03；第二类菌株易致弱，包括菌株Rs-T.1.3-010702-07、Rs-T.1.3-010702-14、Rs-T.1.3-010702-17、Rs-T.1.3-010702-18、Rs-T.1.3-010702-19、Rs-T.1.3-010702-20、Rs-T.1.3-010702-21、Rs-T.1.2-010618-07、Rs-C.1.4-010704-02、Rs-G.1.4-010704-01、Rs-G.1.4-010704-02和Rs-E.1.3-010719-02；Bs-8093菌株对第三类菌株的致弱能力处于第一类和第二类之间，包括菌株Rs-E.1.3-010719-04。关键词：Bs-8093菌株，鉴定，致弱作用IdentificationofStrainBs-8093andItsAttenuationEffectsonVirulentStrainsofRalstoniasolanacearumZhouXian-zhi，ZhangQing-wen，LinYing-zhi，ZhuYu-jing，LanJiang-lin，LiuBo(1.BiotechnologyResearchinstitute，FujianAcademyofAgriculturalSciences，Fuzhou350003，China；2.collegeofAgronomyandBiotecnology，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100094，China)Absract:ThebacteriumstrainBs-8093isolatedfromthesoiloftomatofield.ThisstrainwasidentifiedasBacillussphaericusaccordingtoitsmorphological,physiologicalandbiochemicalcharacteristics,Fattyacidchromatogramand16SrDNAsequenceanalysis.Theoptimumtemperatureforthegrowthofthestrainwas30-35℃.Bs-8093hasattenuationeffectsonvirulentstrainofR.solanacearum,accordingtothedifferenceattenuationabilityofstrainBs-8093to17strainsR.solanacearum,the17strainsdividedinto3groups,thefirstgroupisdifficulttoattenuate,includingstrainRs-T.1.3-010702-01,Rs-T.1.3-010702-25,Rs-T.1.3-010702-27,Rs-E.1.3-010719-03.Thesecondgroupiseasytoattenuate,includingstrainRs-T.1.3-010702-07,Rs-T.1.3-010702-14,Rs-T.1.3-010702-17,Rs-T.1.3-010702-18,Rs-T.1.3-010702-19,Rs-T.1.3-010702-20,Rs-T.1.3-010702-21,Rs-T.1.2-010618-07,Rs-C.1.4-010704-02,Rs-G.1.4-010704-01,Rs-G.1.4-010704-02andRs-E.1.3-010719-02.Thethirdgroupbetweenthefirstandthesecond,includingstrainRs-E.1.3-010719-04.Keywords:bacteriumstrainBs-8093;identification;attenuationeffects细菌性青枯病是一种由青枯雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起的毁灭性土传病害。青枯雷尔氏菌可危害几百种植物，寄主植物包括番茄、马铃薯、烟草、茄子、辣椒、花生、姜、香蕉、甘茹、麻等[1，2]。青枯病原菌从土地表层到深层均有分布，由植株根部侵入，在植株导管内扩散，引发作物青枯病[3，4]。对于细菌性青枯病的防治，前人已在农业防治[5]、化学防治[6，7]、生物防治[8-10]等方面进行了深入研究，由于我国人多地少，耕地有限，农业防治受到极大限制[11]，化学防治污染环境[12],利用生物防治青枯病逐渐受到重视[13]，具有广泛的发展前景。本研究中心从发病番茄的根际土壤中分离到一株芽孢杆菌Bs-8093菌株，发现其对青枯雷尔氏菌强致病力菌株有致弱作用[14]。致弱作用不是将病原菌杀死，而是通过生防菌的作用使强致病力菌株致病力下降或丧失。本文对该杆菌进行了形态特征、培养特征、生理生化鉴定、脂肪酸分析以及基于16SrDNA的序列分析，进一步研究了Bs-8093发酵液对不同强致病力青枯雷尔氏菌的致弱能力的差异。基金项目：国家863计划项目（2006AA10A211）；福建省发改委重大专项（闽农产（2006）10号）作者简介：周先治（1976-），博士研究生，助理研究员。*通讯作者：E-mail：[e-mail]1材料和方法1.1菌种来源菌株Bs-8093系本研究室分离保存的菌株。试验所用青枯雷尔氏菌见表1。1.2培养基Bs-8093菌株的培养用PBMY培养基[15]，青枯雷尔氏菌的液体培养用SPA培养基[16]，青枯雷尔氏菌的分离使用TTC培养基[17]。表1青枯雷尔氏菌菌株来源Table1SourceofRsolanacearu序号Serialnumber菌株编号Strain采集地点Placeofsource寄主Hostplant1Rs-T.1.3-010702-01福州北峰Fuzhoubeifeng番茄Tomato2Rs-T.1.3-010702-07福州北峰Fuzhoubeifeng番茄Tomato3Rs-T.1.3-010702-14福州北峰Fuzhoubeifeng番茄Tomato4Rs-T.1.3-010702-17福州北峰Fuzhoubeifeng番茄Tomato5Rs-T.1.3-010702-18福州北峰Fuzhoubeifeng番茄Tomato6Rs-T.1.3-010702-19福州北峰Fuzhoubeifeng番茄Tomato7Rs-T.1.3-010702-20福州北峰Fuzhoubeifeng番茄Tomato8Rs-T.1.3-010702-21福州北峰Fuzhoubeifeng番茄Tomato9Rs-T.1.3-010702-25福州北峰Fuzhoubeifeng番茄Tomato10Rs-T.1.3-010702-27福州北峰Fuzhoubeifeng番茄Tomato11Rs-T.1.2-010618-07福州金山Fuzhoubeifeng番茄Tomato12Rs-C.1.4-010704-02福州永泰fuzhouyongtai辣椒Capsicum13Rs-G.1.4-010704-01福州永泰Fuzhouyongtai生姜Ginger14Rs-G.1.4-010704-02福州永泰Fuzhouyongtai生姜Ginger15Rs-E.1.3-010719-02福州北峰Fuzhoubeifeng茄子Eggplant16Rs-E.1.3-010719-03福州北峰Fuzhoubeifeng茄子Eggplant17Rs-E.1.3-010719-04福州北峰Fuzhoubeifeng茄子Eggplant1.3主要试剂DNA纯化试剂盒购于杭州博日生物技术有限公司，ExTaq酶、PCR产物克隆试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司。1.4Bs-8093菌株的鉴定1.4.1培养性状及形态观察采用革兰氏染色、孔雀绿染色[17]，电子显微镜进行菌落形态观察。1.4.2生理生化特征参照文献[18-19]对Bs-8093菌株进行生理生化鉴定。1.4.3脂肪酸分析细菌培养：TSB培养基。采用美国MIDI公司的全自动微生物鉴定系统对分离纯化后的细菌菌株进行鉴定。分析软件：美国MIDI公司开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定细菌的软件SherlockMIS4.5（MicrobialIdentificationSystem）和LGS4.5（LibraryGenerationSoftware）。气相色谱条件:进样口温度：250℃；柱温：170℃经5℃·min-1升至260℃，再经40℃/min升至310℃保持1.5min；检测器温度：300℃；载气：H2；载气流量：50ml·min-1；柱前压：9psi；进样模式：分流进样；分流比：100∶1；辅助气：Air350ml·min-1，H230ml·min-1；尾吹气：N230ml·min-1；进样量：2.0μL。1.4.416SrDNA的序列分析参照文献[20]提取基因组总DNA，采用引物fD1（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和rP2（5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）[21]扩增目标菌株的16SrDNA序列。PCR扩增的反应条件为94℃5min，94℃1min、55℃1min、72℃2min共30个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物经纯化后连接到pMD18-T载体，转化EscherichiacoliDH5α，蓝白班法用于筛选转化子。采用BLAST软件对序列进行同源性比较，用DNAMAN软件分析不同菌株之间的遗传距离。1.5Bs-8093菌株生物学特性测定1.5.1生长曲线测定将Bs-8093菌株接种到PBMY培养基中，于30℃、180r.min-1下培养，接种的前36h，每4h测定一次600nm下的OD值，36h后每12h测定一次，每处理重复3次。1.5.2温度对生长的影响将Bs-8093菌株接种到PBMY培养液中，置于15、20、25、30、35、40、45和50℃的恒温箱培养，48h后在600nm下测其OD值，每处理重复3次。1.5.3碳、氮源利用在基础培养基中分别加入蔗糖、乳糖、棉子糖、腺嘌呤、甘氨酸、亚油酸、苹果酸作为碳源，以不加碳源的为对照，在基础培养基中加入胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、氯化铵、硝酸铵、尿素作为氮源，以不加氮源为对照，每处理重复3次。培养基分装于试管内，接种Bs-8093菌株于30℃的摇床（110r·min-1）培养，3d后培养液明显比对照管混浊者为利用该碳（氮）源，否则为不利用。1.6青枯雷尔氏菌的致病性测定将新鲜培养10h的菌液按1.0%的比例接入SPA液体培养基于30℃、180r•min-1下培养48h，用无菌水稀释到1.0×109cfu•mL-1，并参照文献[22]进行青枯雷尔氏菌致病性测定，每个菌株回接30株番茄组培苗，用清水作对照，置于30℃人工气候箱内（L:D=12:12，RH:80-90%）培养，从接种之日起连续20日，记录接菌苗的发病期、每日发病率。1.7Bs-8093菌株对青枯雷尔氏菌致弱作用的测定将新鲜培养10h