水稻胚芽鞘的衰老_百替生物

@[e-mail]@[e-mail]水稻胚芽鞘的衰老专业：植物学学号：D06058学生：孔妤导师：王忠教授摘要：摘要：摘要：摘要：我们对水稻胚芽鞘细胞的死亡做了研究。在淹水条件下种子萌发产生的胚芽鞘比氧充足条件伸长。位于一侧的特定细胞发生死亡诱导胚芽鞘缺口打开，芽鞘快速伸长尽快到达通气区域，从而降低第一叶厌氧毒害的积累。另外一种细胞死亡以溶生性通气组织的形式出现。伴随着胚芽鞘的衰老，叶绿素开始降解，组织明显变棕色。TUNEL法检测到的DNA片段以及DNA梯状条带进一步验证了胚芽鞘细胞的衰老死亡。胚芽鞘的分离蛋白质经检测发现有两种核酸酶(Nuc-a和Nuc-b)，Nuc-a一般在细胞死亡的三个阶段都可观察到，需要结合Ca2+或Mg2+中的任意一种，然而Nuc-b出现在衰亡阶段，需要Ca2+和Mg2+共同激活。Zn2+能有效抑制这两类核酸酶。关键词关键词关键词关键词::::胚芽鞘，细胞死亡，TUNEL，DNA断裂，核酸酶洪涝引起的土壤淹水，是导致维管植物氧缺乏最常见的环境因素。水稻是长期适应淹水环境的一种典型植物(Avadhanietal.,1978)，并且它的胚芽鞘在完全缺氧环境中可伸长。胚芽鞘保护真叶免遭土壤压力及其它机械作用，同时还可为发育分化的组织提供营养。(FroÈhlichandKutschera,1995)。依照Esau(1965)的叶理论解释胚芽鞘不具有普遍性。有人认为它是盾片、盾片鞘的产物，而不是由顶端分生组织分化形成。另一种观点认为胚芽鞘和中胚轴是两类完全不同的器官，它们的发生过程不存在相似性。通气组织贯穿于水稻植株的胚芽鞘、根、叶中脉以及叶鞘内(Hoshikawa,1989；Matsukuraetal.,2000)。近年我们已报道了水稻根内通气组织的形成过程是特定位置上的细胞死亡(Kawaietal.,1998;Samarajeewaetal.,1999)。大量的证据表明，通气组织提供了一种扩散途径，使氧从植物的气生地上部向渍水或缺氧的根系运输仅要很小的阻力(Armstrong,1971;KawaseandWhitmoyer,1980)。稻种萌发后胚芽鞘快速伸长，像一个伸向大气中的“通气管”。Inada(1998a，b)等人报道，成熟种子中胚芽鞘已分化完全,种子经吸胀作用后开始出现，白色带黄的胚芽鞘，快速伸长至实际大小，并在3天内颜色转为灰绿色。当第一叶发育成形胚芽鞘停止生长，圆柱状胚芽鞘具有纵向快速分裂特性。幼苗长至三叶期，胚芽鞘变为褐色，完全衰老死亡。因而胚芽鞘是水稻萌发以后最先发生衰老死亡的组织。叶片长至一定的叶龄，或者植株进入一定的生殖生长阶段，即使生长在最适环境中，某些器官或组织也会发生衰老死亡(Buchanan-Wollaston,1997；Orzaez和Granell,1997)。McManus等(1998)对老叶进行了研究，发现细胞核大小及核内染色质均发生显著变化。此外,Yen和Yang(1998)同样证实叶片衰老过程中存在大量的DNA片段。我们对水稻幼苗设置淹水处理后转移至氧充足环境，研究目标在于阐明水稻幼苗胚芽鞘伸长过程中发生细胞死亡。本研究发现胚芽鞘发育存在空间上的规律性，另外我们对衰老过程中核酸酶的活性加以检测。1.材料与方法1.1材料以水稻（OryzasativaL.)品种为材料，种子放在一定湿度的纱布上，置于玻璃试管内培养，于230C连续光照4d。设置淹水处理，将萌发的稻种完全浸没在水中（水面以下8cm），玻璃瓶和水都经过高温灭菌，抽真空30分钟，抽空瓶中气体及溶解氧后立即密封。为促进细胞死亡，幼苗经淹水处理7d后转置空气中，室温230C培养。我们用溶解氧测定仪(OM-14,HORIBA,Tokyo,Japan)测定水中氧浓度。选择生长14天的水稻幼苗作为观察衰老胚芽鞘的材料。1.2方法1.2.1胚芽鞘的观察切取5mm长的胚芽鞘固定于4%的多聚甲醛（20mM二甲基砷酸钠缓冲液配制，pH7.0），40C过夜。经酒精梯度脱水至纯酒精，树脂(Technovit8100)包埋。切片观察，厚度10um，0.1%甲苯胺蓝染色，显微照相，利用图像放大系统测定细胞长度。1.2.2伊文思蓝染色用2.5%伊文思蓝染色胚芽鞘的徒手切片。1分钟后用蒸馏水冲洗，光学显微镜下观察照相。在观察之前，可以对整株幼苗进行2.5%伊文思蓝染色，再用水冲洗，以确定取样位置。1.2.3TUNEL法检测@[e-mail]@[e-mail]法,即脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端原位标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling）可原位反应细胞核DNA断裂情况。利用TUNEL法原位标记凋亡检测试剂盒,染色体DNA双链断裂或单链断裂产生大量的3’-OH末端，将脱氧核糖核标记到DNA的3'-末端，从而可检测到凋亡细胞。方法参照说明，具体步骤如下：组织切片用冷风吹干后，放在通透液（0.1%Triton-100溶于0.1%柠檬酸钠溶液）孵育15分钟，经PBS漂洗，滴加TUNEL反应混合溶液，DAPI显色，封片后显微镜观察并照相。1.2.4DNA的提取和片段化检测胚芽鞘在液氮中研磨成粉末，加入提取缓冲液(5mMTris-HCl,pH8.0,20mMEDTA和0.5%TritonX-100)，用等体积的苯酚/氯仿(1：1)混合物抽提一次，8000×g离心15分钟。加入等体积异丙醇使核酸全部沉淀出来。1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙啶染色后将凝胶置UV透射仪上观察。1.2.5核酸蛋白凝胶系统分析（nucleasein-gel-assay）粗酶液提纯（50mMHEPES缓冲液，pH8.0，330mM山梨醇，20mMEDTA和1mMPMSF)。匀浆后超声波降解,40C，5000×g离心15分钟。取上清液用作SDS-PAGE。电泳之后,凝胶在500C反应混合液（20mMTris-HCl缓冲液，pH7.5，5mM2-巯基乙醇）中孵育1h，40CTris-HCl缓冲液中过夜。370C凝胶置于混合液（50mMTris-HCl缓冲液，pH7.5，3mMCaCl2,3mMMgCl2和1mM2-巯基乙醇）中孵育10-24h。为检测核酸酶的活性，凝胶经溴化乙啶染色后置UV透射仪上观察。滴加10mMEDTA(pH8.0)或3mMZnSO4于反应混合液，分析核酸酶结合离子情况。用考马斯亮蓝G-250法测定酶液中的总蛋白质含量。2.结果2.1淹水缺氧和氧充足条件下胚芽鞘细胞的比较对水稻幼苗胚芽鞘生长情况进行研究，设置两种处理：完全淹水缺氧和氧气供应充足。培养4天后，完全淹水的水稻胚芽鞘比氧供应充足条件伸长的快(Fig.1A)，但是其颜色不为绿色，并且根的生长受到抑制。缺氧和氧充足条件下胚芽鞘伸长情况存在显著差异，我们取胚芽鞘纵切面的中间剖面，对芽鞘细胞的长度加以比较(Fig.1B，C)。完全淹水的胚芽鞘细胞长度是氧充足情况下的几倍(Fig.1D)。厌氧条件下胚芽鞘伸长的实质是芽鞘细胞的延伸生长。水稻幼苗胚芽鞘的纵切面观察发现，在氧充足环境中生长的芽鞘出现通气空腔(Fig.1B),而淹水厌氧条件没有发生此类空腔(Fig.1C)。淹水第一天水中溶解氧浓度为3.00mg·l-1,种子萌发后48h减至0.38mgl-1，因而可将淹水情况确定为低氧或者氧不足条件。230C时水中溶解氧浓度为8.39mg·l-1以达到与大气平衡。为了检测细胞死亡现象,胚芽鞘中央部位的徒手切片染上伊文思蓝(Fig.2)。伊文思蓝是一种与活细胞质膜相斥的染料,死细胞膜破损可渗入该染料。不管是淹水缺氧(Fig.2A,B,D)还是通气(Fig.2C)环境下生长的胚芽鞘内都可见到两个大的维管束。在氧充足条件下，芽鞘的维管束两侧或邻近部位有通气组织形成(Fig.2A,B,D)。我们可观察到空腔或崩溃区域的细胞被染上伊文思蓝,这些细胞即将形成通气组织(Fig.2B,D)。此外，同样发现胚芽鞘缺口周围那层细胞染上较深的伊文思蓝(Fig.2E)。淹水条件生长的胚芽鞘既无空腔也未染上伊文思蓝的细胞(Fig.2C)。FIG1.A淹水缺氧和氧充足条件下生长4天的水稻胚芽鞘，箭头所指为胚芽鞘；B、C胚芽鞘的纵切面，氧充足(B)和淹水缺氧(C)，ae,通气组织，bar.100mm；D胚芽鞘薄壁组织细胞的平均长度(n＝60)@[e-mail]@[e-mail]2.2氧充足促进胚芽鞘成熟和细胞死亡如图1所示,浸没在水中的胚芽鞘伸长情况。通过这样的胚芽鞘我们可以区分成熟或衰老时发生的细胞死亡，如图3A。淹水条件下生长7天的胚芽鞘伸长至通气区域,72h后胚芽鞘开始变绿，96h后第一叶从胚芽鞘开口处完全抽出。伴随着叶绿素的分解退化，96h后表现出典型的衰老症状。为进一步检测胚芽鞘的缺口区域，对不同天数的幼芽用伊文思蓝染色(Fig3B-E).暴露于氧充足条件下6h后，在近轴区域纵向少数部位标记上蓝色(Fig3C和E),24h后这些部位由于胚芽鞘开裂引起细胞死亡(Fig.3D,F)。在6h后,胚芽鞘以内的第一叶不再伸长。为了确定细胞死亡发生的初始位置，进一步对胚芽鞘的缺口区域进行研究。淹水7天的水稻幼苗(Fig.4A,C)转至通气环境中。可以发现在胚芽鞘出现缺口之前有一层排列紧密的细胞，它们即将发生细胞死亡(Fig.4C)。6h后缺口由近轴表层向外开始延伸(Fig.4D)。缺口处一般位于整个胚芽鞘长轴的中心区(Fig.4E)。因而缺口位置是可预测的，且位于两个维管束的正中间。我们还发现胚芽鞘的缺口表现于某些特定的细胞。24h后胚芽鞘完全断开(Fig.3D)。此外48h后细胞开始发生崩溃形成通气空腔，为伊文思蓝染色。通气空腔于96h分化形成(Fig.4B)。在空隙或气腔的扩大贯穿于胚芽鞘发育成熟和衰老整个过程。FIG4.由淹水移至空气中生长的胚芽鞘横切面示意图。A、B分别为0h和96h。B中箭头所示为通气组织。C和D分别为移至大气中0h和6h后缺口部位的放大图。胚芽鞘部分区域被染上伊文思蓝。C、D中箭头所指为缺口发生部位。Bar.50mm.E当胚芽鞘移至大气6h后出现缺口，位置一般是固定的，伊文思蓝标记该位点，结果以所占百分比表示。胚芽鞘内第一叶出现的位置如E图所示。n＝60.（如下图）FIG2.氧充足条件下生长4天的胚芽鞘，可观察到发生细胞死亡的区域(A,B,D和E)及淹水7天的胚芽鞘(C)。取胚芽鞘中间部位的横切面(A)，伊文思蓝处理后发生死亡的细胞染上蓝色(B-E)；D为B的放大图。E断开的缺口区域染上伊文思蓝，图中箭头所指为维管束，Bar.100mm.FIG3.A，取淹水处理7天的水稻幼苗（0h）移至空气中，分别观察24,48,72,96和144h幼苗的生长变化情况。箭头所指为衰老的胚芽鞘。Bar.1cm。胚芽鞘转至通气环境0h(B)，6h(C和E)、24h(D)，用伊文思蓝染色观察细胞死亡情况。E是C的放大图，C、E图中箭头所指为染上伊文思蓝的部位。Bars.0.2c