CHO细胞大规培养

1--摘要CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr.TheodoreT.Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞。微载体细胞培养开始于19世纪60年代末期，最早使用离子交换凝胶（DEAE-SephadexA50）作为载体，轻微搅动即可悬浮在培养基中。由于这种微载体带有电荷，利于细胞贴附于载体上进行生长繁殖。载体处于悬浮状态时，这样既可大大增加细胞附着面积，又使细胞能与培养基充分接触，进而有利于细胞的生长，因此能达到大量培养细胞的目的。后来根据细胞附着生长的特点，对微载体进行改良，使其电荷或其介质更利于细胞附着和生长。培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面，1g微载体其比表面积可达6000cm2，从而可实现细胞的高密度培养。首先将CHO细胞在无血清培养基（SAF-CHO-G-004）中进行无血清驯化。其次将CHO细胞（成功用无血清驯化后的细胞）用0.25%胰酶消化制成细胞悬液后，沿导流管加入含明胶微载体和SAF-CHO-G-004细胞培养基的WhcltonBioster瓶罐中连续培养生成一定量的种子细胞。最后将种子细胞进行大规模培养。运用半连续式培养来操作：在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。最后在细胞培养过程中进行细胞常数的检查和培养基内污染物的检测一些抗凋亡策略来增加细胞培养的效率。[关键字]CHO细胞;明胶微载体;无血清培养;半连续式培养2--目录摘要.......................................................1关键字：CHO细胞明胶微载体无血清培养半连续式培养..........1绪论.......................................................31.2CHO细胞培养的特性.......................................32.2.1培养基的物理性质......................................52.2.2无血清培养............................................73.1.2蛋白质作基质的微载体..................................83.1.3微载体培养原理与操作..................................93.2.2微载体培养种子细胞...................................123.2.3微载体培养的细胞传代.................................123.3半连续式培养（semi-continuousculture）操作...........124.2细胞常数检查...........................................144.3CHO细胞培养内污染物的检测..............................144.3.2真菌污染对细胞的影响及污染物的检测...................154.3.3支原体污染对细胞影响及污染物的检测...................165抗凋亡策略在细胞大规模培养中的应用.......................165.1营养物质抗凋亡........................................175.2基因抗凋亡............................................175.3化学方法抗凋亡........................................17参考文献：................................................183--绪论1.1引言CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr.TheodoreT.Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-_-半醛，培养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。1.2CHO细胞培养的特性CHO细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素；培养过程需氧量少(氧传质系数kLa大于10h-1即可满足每毫升107个细胞的生长)；培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡；代谢产物具有生物活性，4--生产成.本高，但附加值也高。2.1DMEM培养基的组成与制备2.1.1DMEM培养基的组成将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水（水温20℃～30℃）到950毫升，轻微搅拌溶解。（1）加入2.438克碳酸氢钠。序号化合物名称含量(mg/L)序号化合物名称含量(mg/L)1无水氯化钙200.0017L-丝氨酸42.002硝酸铁.9H2O0.1018L-苏氨酸95.003氯化钾400.0019L-色氨酸16.004无水硫酸镁97.6720L-酪氨酸钠盐104.005氯化钠6400.0021L-缬氨酸94.006无水磷酸二氢钠125.0022D-泛酸钙4.007L-盐酸精氨酸84.0023氯化胆碱4.008L-盐酸胱氨酸63.0024叶酸4.009L-谷氨酰胺584.0025肌醇7.2010甘氨酸30.0026烟酰胺4.0011L-盐酸组氨酸42.0027核黄素0.4012L-异亮氨酸105.0028盐酸硫胺4.0013L-亮氨酸105.0029盐酸吡哆辛4.0014L-盐酸赖氨酸146.0030葡萄糖1000.0015L-甲硫氨酸30.0031丙酮酸钠110.0016L-苯丙氨酸66.0032酚红15.005--（2）轻微搅拌溶解，加注射用水至1升。（3）用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至所需值。（4）用0.2μm滤膜正压过滤除菌。（5）溶液应在2℃－8℃下避光保存。2.2.1培养基的物理性质无菌：无菌是保证培养细胞生存的首要条件。培养液不仅对细胞是高营养物，对细菌和霉菌也是高度营养物，细胞培养中如污染微生物，其繁殖比细胞快且能产生毒素使细胞死亡，因此细胞培养技术的关键之一是防止污染。污染微生物可来源于组织培养液、器皿、组织本身、工作者本身。因此，培养室的空气等要彻底消毒，所有操作均要严格实行无菌操作，各种物品拿入操作台前应消毒，用洒精擦表面，用前于紫外线照；操作者洗手、泡手，酒精擦手，打开培养管前须在火焰上烙烧一下瓶口以使灰尘固定，操作时须将瓶、管斜放，吸管注入液体应避免和瓶口接触，操作时禁止讲话。温度：组织培养的最适温度为35-37℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。培养细胞对低温的耐受力比高温强。温度增加2-3℃对细胞产生不良影响，使之在24小时死亡，温度在43℃以上，细胞大多被杀灭，而低温对细胞影响较小，细胞置于25-35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度缓慢，放在4℃数小时之后，再置37℃培养，细胞仍能继续生长。6--气体：气体也是细胞生存的必需条件之一。所需的气体主要有O2和CO2。O2参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。CO2既是细胞代谢产物也是细胞所需成分。它主要与维持培养液pH值有直接关系。pH值：多数细胞的适宜pH值为7.0-7.4，偏离此范围对细胞可产生有害的影响。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐/CO2。细胞代谢产生的各种酸使pH下降，而培养液中的NaHCO3产生CO2排入空间又使pH增加。培养器皿的处理：培养器皿处理的好坏与否对于细胞的贴壁生长影响很大。它们只有贴附于不起化学作用的物体的表面时，才能生长、生存或维持功能。目前，常用的器皿主要有玻璃及塑料二大类。玻璃器皿一般须用清洁液浸泡1至7天，清水冲洗20次后再用蒸馏水过洗2次，烤干备用。用前160℃高温消毒2小时后使用。96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡4小时后，清水洗净再用1NHCL浸泡4小时，用清水冲洗后再用蒸馏水漂洗，37℃干燥后，紫外线灯照射消毒；新橡皮塞须先用1/2NnaOH煮沸15分钟，冲洗后再用4%HCL煮沸15分钟，清水冲洗后用蒸馏水洗5次，煮沸10分钟灭菌，或送高压灭菌。总之，细胞在适当的培养条件下可迅速增殖，但若遇到不良环境细胞会变圆，停止生长，甚至死亡，这是细胞的保护机制。综上所述，细胞培养的基本条件主要包括了营养液、无菌条件、PH、温度、气体条件和培养器皿的清洁度。培养液水质7--配制培养液前要制备纯净的水。平衡盐溶液组织培养中所用的各种平衡盐溶液主要有三个功效：作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压;提供缓冲系统，是培养液的酸碱维持在培养细胞生理范围内;提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子。因此，平衡盐溶液的组成和含量应符合如下条件：要与培养物来源的动物血清相近似；呈溶液状态，利于物质的传递和扩散；是等渗的，否则会引起细胞的收缩（高渗透压）和膨胀（低渗透压）.2.2.2无血清培养无血清培养基(serumfreemedium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。以ＤＭＥＭ基础培养基，并添加了维生素Ｃ、转铁蛋白、乙醇胺、羟基丁酸钠等成分。无血清培养基的组成及其主要补充成分:激素和生长因子8--、结合蛋白、贴壁因子和扩展因子、低分子量营养因子、微量元素。特别需要强调的是：配制无血清培养液必须使用高质量的水，如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，既便水中的有毒物质含量甚微，也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：（1）处于对数生长中期（2）90%活细胞率（3）适应时以较高的起始细胞接种3细胞培养方法与操作3.1细胞培养方法固定化培养方法在动物细胞培养中，培养细胞的目的不仅仅要求催化活细胞培养中，培养细胞的目的不仅仅要求催化活力，更重要的是利用细胞来合成和分泌蛋白，因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。由于动物细胞的极度敏感性，上述这些固定化方法会对动物细胞产生毒性，另外多糖(如卡拉胶等)由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害。微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术。这种培养技术是在生物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒(微载体)，使细胞在微载体表面附着和生长，并通9--过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表