津田芜菁花色素苷生物合成相关基因的表达

583植物生理与分子生物学学报,JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology2006,32(5):583-5862006-01-21收到，2006-08-08接受。国家自然科学基金项目(No.30170785)和黑龙江省博士后政府资助经费资助。*通讯作者(E-mail:[e-mail];Tel:[phone])。‘津田芜菁’花色素苷生物合成相关基因的表达许志茹，李玉花*东北林业大学生命科学学院，哈尔滨150040摘要：利用黑暗、日光、人工恒定光处理花色素苷合成依光型的‘津田芜菁’试材。通过紫外-可见分光光度计测定恒定光处理下‘津田芜菁’块根皮中花色素苷的含量，结果表明，花色素苷含量与光处理时间成正相关。用从消减文库中筛选的花色素苷生物合成基因片段制备探针，Northern杂交结果显示，在所处理的48h之内，光可以诱导‘津田芜菁’中PAL、DFR、CHS、F3H和ANS基因的表达，这些基因的表达量随着光处理时间的延长而增加，而MYB基因的表达量在黑暗与光下基本相同。关键词：‘津田芜菁’；光；花色素苷；基因表达中图分类号：Q74花色素苷包括花青素、花葵素和翠雀素，花色素苷的种类和数量决定花、果实和种子的颜色。花色素苷由一系列酶催化合成，目前对花色素苷合成途径的研究已取得一定进展，一些催化合成花色素苷的酶基因已被克隆(赵云鹏等2003)。采用反义RNA技术及过量表达新基因等技术已实现了对花色的修饰(柴明良和汪炳良2002)。已知的催化花色素苷生物合成的主要酶有：苯丙氨酸解氨酶(PAL)、苯基苯乙烯酮合成酶(CHS)、苯基苯乙烯酮黄烷酮异构酶(CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(F3H)、二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)、花色素合成酶(ANS)和类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(UFGT)。花色素苷的生物合成需要转录因子的调控(Mehrtens等2005)，并且花色素苷合成与否及合成量与光受体和光信号转导因子密切相关(Sheehan等2004)。芜菁(BrassicacampestrisL.ssp.rapa)别名小蔓菁，十字花科芸苔属芜菁亚种。花青素生物合成依赖于光的‘津田芜菁’(‘Tsuda’turnip)块根着色时需要光，受光一侧呈紫红色，背光一侧呈白色。本试验以‘津田芜菁’为试材，利用从‘津田芜菁’消减文库中筛选到的花色素苷生物合成基因片段和转录因子片段制备探针，通过Northern杂交技术研究这些基因在不同光处理试材中表达量的变化。1　材料与方法1.1　材料取温室种植的‘津田芜菁’(‘Tsuda’turnip)自交纯系块根放在土中避光生长。块根膨大2个月后进行光照处理。分别用日光(自然光照，春分时节一天中光强度有所变化，非定值)处理块根0h、3h、6h、9h、12h、24h和48h，人工气候箱中的恒定光(27.9W/m2)处理块根0h、6h、12h、18h、24h和48h，取处理的块根和未光照的白色对照块根进行试验。1.2　引物序列与试剂从本实验室构建的‘津田芜菁’的消减文库(‘津田芜菁’光照处理的红色块根皮消减未光照的白色块根皮)中筛选到了PAL、CHS、F3H、DFR、ANS和MYB的基因片段，用primerprimer5软件设计探针合成的引物。Ex-Taq聚合酶及DNAMarker等购自宝生物工程(大连)有限公司。Northern杂交部分试剂购自Roce公司。TrizolRNA提取液：硫氢酸胍0.8mol/L，硫氢酸铵0.4mol/L，醋酸钠0.1mol/L(pH5.0)，5%甘油，38%Tris-饱和苯酚。1.3　色素含量的测定对未见光的‘津田芜菁’块根进行恒定光照处理。用刀片取同一组织部位的块根皮置于色素提取液(含1%盐酸的甲醇溶液)中，4°C放置24h(Kawabata等1999)。用紫外-可见分光光度计扫描吸收曲线，测定‘津田芜菁’在530nm具有最高光吸收值。测定处理样品530nm的光吸收值。以OD值表示花色素苷的含量。对于白色块根，分别取根皮和根肉测定花色素苷含量。色素含量的测定重复58432卷植物生理与分子生物学学报3次。1.4　总RNA的制备根据Chomczynski和Sacchi(1987)提出的一步抽提法，略有改变。在1mLTrizol提取液中加入研磨的块根皮粉末，迅速混匀，振荡10min。加入0.3mL氯仿，振荡5min，13200×g离心10min。取上清液，加入0.7mL氯仿，振荡5min，13200×g离心10min。取上清，加入1/2体积的1.2mol/L氯化钠和等体积异丙醇，室温下静置10min，13200×g离心10min，弃上清液。75%乙醇洗涤沉淀，加入20μL无菌去离子水溶解RNA。1.5　Northern杂交用Roce公司的地高辛标记试剂盒制备探针。低电压长时间(50V,5h)电泳总RNA，每个点样孔RNA上样量为15μg。检测电泳效果后，将总RNA吸印转移到尼龙膜(Amershambiosciences)上。杂交及信号检测使用DIGNucleicAcidDetection试剂盒和CPD-Star(Roche)。重复3次。2　结果与讨论2.1　光照对‘津田芜菁’块根皮花色素苷含量的影响经恒定光照后的块根皮色素含量随光照时间的延长而增加。MINITAB方差分析结果表明，样品之间的P值为0.314，表示相同处理的样品之间不存在差异；处理不同时间的样品之间的P值小于0.05，说明不同时间光照后色素含量差异显著(表1)。其一元线性回归方程为：花色素苷含量=-0.00656+0.01265×光照时间，其中标准误(s)为0.0260210，相关系数(r)为98.8%。回归线如图1。在花色素苷测定过程中发现，未见光的‘津田芜菁’块根皮在530nm也有吸收值。选取未见光试材，测定块根皮和块根肉OD530值。方差分析结果表明(数据未显示)，各块根皮样品之间、各块根肉样品之间及块根皮和块根肉之间的P值均大于0.05，说明差异均不显著，即选取的未见光‘津田芜菁’在进行试验之前未受到光照诱导，白色块根有较低的OD值可能是由其他物质在530nm存在一定光吸收值造成的。表1　恒定光照不同时间‘津田芜菁’花色素苷含量变化的方差分析Table1　Varianceanalysisofanthocyaninintaprootpeelof‘Tsuda’turniptreatedwithdifferenttimeofconstantlightSourceDegreeoffreedomSumofsquaresMeansquaresFProbabilityNumber140.029140.002081.150.314Time510.459222.091841157.340.000Error2500.451860.00181Total26910.94022图1　恒定光照对‘津田芜菁’块根花色素苷含量的影响Fig.1　Regresslineofanthocyaninintaprootpeelof‘Tsuda’turniptreatedwithconstantlight2.2　光照对花青素生物合成催化酶基因表达的影响提取的‘津田芜菁’总RNA完整性良好，28S和18SrRNA的亮度比接近2:1，A260/280为2.01，可以用于Northern杂交。地高辛标记的探针比对照PCR的电泳条带滞后是由于探针的分子量大的缘故(数据未显示)。Northern杂交结果(图2)显示：白色块根皮中F3H基因的表达量极低，光照处理48h后F3H的表达量明显增加。MYB基因的表达量在2种处理试材中无显著变化。对块根进行不同时间的日光光照处理，Northern杂交结果显示(图2):未见光(D)、3h、6h、9h、12h处理试材中F3H的表达量逐渐增强，24h的表达量变弱，48h又增强；MYB基因的表达量在各种处理试材中没有明显变化。由于日光强度及日周期变化，同时由于处理过程中有超过9h的处理时间，只能先将处理试材重585许志茹等:‘津田芜菁’花色素苷生物合成相关基因的表达5期新遮光，第2天再接着进行光处理，这样植物体内的mRNA有可能由于寿命的长短而降解，从而影响最终的检测结果。为排除上述影响因素，用恒定光照处理块根以研究花色素苷合成相关基因的表达变化。恒定光处理块根后杂交结果如图3。PAL基因的表达量在光照6h后大量增加。CHS、F3H、DFR和ANS基因的表达量随着光照时间的延长而逐渐增加，MYB基因的表达量无明显变化。着光照时间的延长而逐渐增加，这与花青素含量的测定结果是相对应的，Noda等(2004)研究的草原龙胆(Eustomagrandiflorum)的花色形成也有类似现象。MYB基因的表达与其它结构基因不同、不受光诱导的原因尚无法解释，它的表达是否与依赖于光的花青素生物合成相关，还需要进一步的试验验证。参考文献BiezaK,LoisR(2001).AnArabidopsismutanttoleranttolethalultraviolet-Blevelsshowsconstitutivelyelevatedaccumulationofflavonoidsandotherphenolics.PlantPhysiol126(3):1105-1115ChaiML(柴明良),WangL(汪炳良)(2002).Thestatusandprospectsofgenetictransformationinseveralflowers.ActHortSin(园艺学报)29(Suppl.):664-670(inChinese)ChomczynskiP,SacchiN(1987).Single-stepmethodofRNAisolationbyacidguanidinium-thiocyanate-phenol-chloroformextraction.AnalBiochem162(1):156-159KawabataS,KusaharaY,LiY,SakiyamaR(1999).TheregulationofanthocyaninbiosynthesisinEustomagrandiflorumunderlowlightconditions.JJapanSocHortSci68(3):519-526MehrtensF,KranzH,BednarekP,WeisshaarB(2005).TheArabidopsistranscriptionfactorMYB12isaflavonol-specificregulatorofphenylpropanoidbiosynthesis.PlantPhysiol138(2):1083-1096NodaN,KannoY,KatoN,KazumaK,SuzukiM(2004).Regulationofgeneexpressioninvolvedinflavonolandanthocyaninbiosynthesisduringpetaldevelopmentinlisianthus(Eustomagrandiflorum).PhysiolPlant122(3):305-313SheehanMJ,FarmerPR,BrutnellTP(2004).Structureandexpressionofmaizephytochromefamilyhomeologs.Genetics167(3):1395-1405ZhaoYP(赵云鹏),ChenFD(陈发棣),GuoWM(郭维明)(2003).Advancesingeneticengineeringofflowercolorofornamentalplants.ChinBullBot(植物学通报)20(1):51-58(inChinese)图3　恒定光照条件下‘津田芜菁’块根中各个基因的表达Fig.3　Expressionofgenesintaprootpeelof‘Tsuda’turnipexpose