EMSAprotocal

简介及原理：EMSA(ElectrophoreticMobilityShiftAssay)凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白或细胞粗提液与标记的DNA或RNA探针一同孵育，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。主要试剂和仪器：1.蛋白质预染分子量marker、NC膜、ECL发光试剂盒、总蛋白测定试剂盒全功能激光影像成像系统、高速组织捣碎机、电泳仪、电泳槽、转印槽、低温高速离心机、超低温冰箱、分光光度计、脱色摇床2.一般binding所用试剂盒包括的试剂10XBindingBuffer（10X结合反应液）(-20℃)Poly(dI:dC)(dI:dC)（聚核苷酸竞争物(-20℃)6XLoadingBuffer（10X上样缓冲液）(4℃)Coldoligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）(-20℃)Biotin-LabeledProbe（生物素标记探针）(-20℃)Streptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）(4℃)2×BlockingBuffer（2×封闭液）(4℃)5×WashingBuffer（5×洗涤液）(4℃)EquilibrationSolution（平衡液）(4℃)Binding-membrane（结合反应膜）(RT)操作步骤：1.探针的标记：⑴将20μl生物素标记的N4-dCTP与80μl的5×dNTP混合物充分混合备用。⑵稀释约100ng线性探针模板至24μl于离心管中。⑶加入10μl随机引物与上述离心管中，煮沸变性5min，迅速在冰水混合物中退火5min。⑷加入10μlN4-dCTP与5×dNTP的混合物，5μl反应缓冲液，1μlklenow酶片，混匀。⑸37℃孵育60min，⑹加入2μl的EDTA以灭活klenow酶活性。合成寡核苷酸---标记生物素---纯化---退火合成双链.也是一个比较复杂的过程。2.探针的纯化：通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：(1)对于100μl标记好的探针，加入1/4体积即25μl的5M醋酸铵，再加入2体积即200μl的无水乙醇，混匀。(2)在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。(3)4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。(4)4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。(5)加入100μlTE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。3.EMSA胶的配制：(1)准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。(2)按照如下配方配制20毫升6.5％的非变性的聚丙烯酰胺凝胶（制胶很重要直接影响电泳结果）。成分含量10×TBEbuffer1.0mlAcrylamide（39：1；40%w/v）3.3ml50%Glycerol1mldH2O14.7mlTEMED20ul脱气10min10%AP120ul按照上述次序加入各个溶液，加入10%AP前先混匀并脱气10min，加入10%AP后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。4.EMSA结合反应：(1)如下设置EMSA结合反应(预期的结果参见图1)：阴性对照反应：Nuclease-FreeWater8μlEMSA/Gel-Shift结合缓冲液(10X)1μl细胞核蛋白或纯化的转录因子0μl标记好的探针1μl总体积10μl样品反应：Nuclease-FreeWater6μlEMSA/Gel-Shift结合缓冲液(10X)1μl细胞核蛋白或纯化的转录因子2μl标记好的探针1μl总体积10μl探针冷竞争反应：Nuclease-FreeWater5μlEMSA/Gel-Shift结合缓冲液(10X)1μl细胞核蛋白或纯化的转录因子2μl未标记的探针1μl标记好的探针1μl总体积10μl突变探针的冷竞争反应：Nuclease-FreeWater5μlEMSA/Gel-Shift结合缓冲液(10X)1μl细胞核蛋白或纯化的转录因子2μl未标记的突变探针1μl标记好的探针1μl总体积10μlSuper-shift反应：Nuclease-FreeWater5μlEMSA/Gel-Shift结合缓冲液(10X)1μl细胞核蛋白或纯化的转录因子2μl目的蛋白特异抗体1μl标记好的探针1μl总体积10μl(2)蛋白与核酸孵育按照上述顺序依次加入各种试剂，注意在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置20分钟，消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。(3)制样在9μl的孵育产物中加入1μlEMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。4.电泳分析：(1)用0.5×TBE作为电泳液。(2)把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1×的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。(3)按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。(4)剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。(5)干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。其中:探针用量:这相当于10-50fmol的DNA探针。我们通常是最少50fmol.蛋白样品用量:一般用量在2～20ug(控制在1-5μl)蛋白,总体系15ul。细胞核抽提物浓度都比较低，组织的一般都比较高，因为杂蛋白较多。poly(dI:dC)(dI:dC):它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液:每2-3ug核抽提液用1ugpoly(dI:dC)(dI:dC)。未标记的竞争性寡核:做为竞争的探针来说,其实就是没有标记的转录因子的寡核苷酸，用量一般是正常探真的50-100倍。◆常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)；◆阴性对照反应(标记探针);◆探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记探针)；◆突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记突变探针)；◆Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋目的转录因子的特异抗体)