2基因工程.

2.基因工程学习目的学习基因工程基本原理和基本操作过程,为进一步学习生物技术相关知识和从事基因工程工作打下基础。2.1基因工程概况2.1.1基因工程的基本含义按照人们的愿望（人为的），进行严密的设计（类似工程设计），通过体外DNA重组（非生命活动过程）和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短的时间内趋于完善（区别于自然突变和常规育种），创造出更符合人们需求的新的生物类型;利用这种技术对人类疾病进行有效的诊断和治疗。基因工程2基因工程2.1.2基因工程的主要理论依据不同基因具有相同的遗传物质(DNA/RNA)基因是可以从DNA上切割下来的基因是可以转移的多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的(绝少数除外)可以通过DNA复制把遗传信息传递给下一代基因工程2.1基因工程概况2.1.3基因工程研究的基本技术路线基因工程2.1基因工程概况2.1.4基因工程突出的优点打破了常规育种难以突破的物种之间的界限可以使原核生物与真核生物之间的遗传信息进行相互重组和转移可以使动物与植物之间的遗传信息进行相互重组和转移可以使人与其他生物间的遗传信息进行相互重组和转移基因工程2.1基因工程概况2.2.1DNA2.2.1.1DNA的组成和结构基因工程2基因工程DNA由腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸组成。脱氧核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸基组成。四种脱氧核苷酸的脱氧核糖、磷酸基的结构和位置相同，只是各自的碱基不同。2.2DNA重组•碱基有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)4种。脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键连接。多个脱氧核苷酸按此方法连接成多聚脱氧核苷酸，其一端为游离的5´-磷酸基(5´P)称为5´端；另其一端为游离的3´-羟基(3´OH),称为3’端。基因工程2.2.1.1DNA的组成和结构基因工程2.2.1.1DNA的组成和结构DNA的双螺旋结构DNA两条脱氧核苷酸链总是按照碱基A与T互补配对和G与C互补配对的，通过氢键形成稳定的双螺旋结构，称为双链DNA。少数病毒和噬菌体中的DNA是以单链形式存在的。（变性，复性，分子杂交）基因工程2.2.1.1DNA的组成和结构B-DNA双螺旋分子模型基因工程2.2.1.1DNA的组成和结构DNA存在形式线形环状（大部分原核生物，部分病毒，全部线粒体，叶绿体，质粒）ccc-DNA,oc-DNA2.2.1.2DNA的功能（1）DNA分子能在细胞内复制以原有的DNA链为模板，从特定的复制起始位点（ori）起始，复制出新的DNA链。（2）DNA是基因的主要携带者一个基因是DNA分子上的一个特定的核苷酸序列。基因工程2.2.1DNA基因工程2.2.1.2DNA的功能原核生物基因启动子相关的保守核苷酸序列Pribnow框或-10区：-4~-13bp之间由６个核苷酸组成，多数是TATAAT序列。-35区：-35bp前后保守的TTGACA序列。SD序列:转录后的mRNA与核糖体小亚基16SRNA结合动、植物基因启动子相关的保守核苷酸序列生物类型TATA区（-25~-30）CAAT区（-70~-80）GC区（-80~-100）动物TATAATAGGCCAACTGCCACACCC植物TCTATATA1~3CA或TGTATAAA1~3CACA2~5GNGA2~4CC或TA2~5TNGA2~4TTGGGCGGG基因工程2.2.1.2DNA的功能终止子发夹结构序列基因工程2.2.1.2DNA的功能2.2.2获得DNA片段的主要途径目的：（1）获得含有基因的DNA片段（2）获得含有基因表达调控因子的DNA片段（3）获得含有与基因重组有关的核苷酸序列的DNA片段主要途径：（1）限制性内切核酸酶酶切法（2）PCR扩增法（3）化学合成法基因工程2.2DNA重组2.2.2.1限制性内切核酸酶和DNA片段化限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease)功能：能识别双链DNA中特殊核苷酸序列,并在合适的反应条件下,使每条链的一个磷酸二酯键断开,产生具有3´OH和5´P的DNA片段。命名：HindIII由HaemophilusinfluenzaeRd中属名的H,种名的in和菌株代号的d组成,III表示从此菌株中提取的第三种限制性内切核酸酶。识别序列规律：旋转对称或左右互补对称(基/偶)。切割位点:在识别序列(内部或两侧)使磷酸二酯键断开的位置。基因工程2.2.2获得DNA片段的主要途径限制性内切核酸酶识别序列、酶切位点和酶切片段末端基因工程2.2.2.1限制性核酸内切酶和DNA片段化粘性末端：产生的DNA片段末端的一条链多出一至几个核苷酸。3´端比5´端长的称为3´粘性末端，5´端比3´端长的称为5´粘性末端。平末端：产生的DNA片段末端是平齐的。限制性内切核酸酶的切割方法:单酶切法双酶切法完全酶切法部分酶切方法环状DNA酶切片段示意图基因工程2.2.2.1限制性核酸内切酶和DNA片段化同裂酶:来源异,识别同同尾酶:识别异,粘性末端同2.2.2.2特异性DNA片段的PCR扩增特点：体外高效扩增特异DNA片段。一个待扩增的DNA片段，在3h内可扩增出约106个这样的DNA片段。关键因子：※耐热性DNA聚合酶※引物基因工程2.2.2获得DNA片段的主要途径反应过程：※反应系统加热至90~95℃,底物双链DNA变性成为两条单链DNA；※降温至37~60℃,使引物与模板DNA链互补序列杂交(复性)；※升温至70~75℃，耐热性DNA聚合酶催化引物按5´→3´方向延伸,合成模板DNA链的互补链。※重复以上过程，一般经过25～30次循环片段。基因工程2.2.2.2特异性DNA片段的PCR扩增基因工程2.2.2.2特异性DNA片段的PCR扩增2.2.2.3化学合成目的基因根据待合成的DNA片段预定的核苷酸序列，采用DNA合成仪，将4种核苷酸单体按3´→5´磷酸酯键连接成寡核苷酸片段。基因工程2.2.2获得DNA片段的主要途径DNA合成仪2.2.3DNA片段的连接2.2.3.1DNA连接酶（DNAligase）催化机理：催化双链DNA片段紧靠在一起的3´OH末端与5´P末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。目前常用的连接酶:E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶。基因工程2.2DNA重组具互补粘性末端片段之间的连接基因工程2.2.3DNA片段的连接2.2.3.2DNA片段之间的连接基因工程2.2.3.2DNA片段之间的连接具平末端DNA片段之间的连接基因工程2.2.3.2DNA片段之间的连接DNA片段末端修饰后进行连接DNA片段末端修饰后进行连接基因工程2.2.3.2DNA片段之间的连接DNA片段脱磷酸化后连接DNA片段末端修饰后进行连接基因工程2.2.3.2DNA片段之间的连接DNA片段加连杆后或加衔接头连接基因工程2.2.3.2DNA片段之间的连接2.2.3.3DNA重组类型插入重组置换重组基因工程2.2.3DNA片段的连接基因工程2基因工程基因克隆载体的含义能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以相对稳定维持的DNA分子称为基因克隆载体（genecloningvector）。基因克隆载体应具备的基本条件具有1个或多个克隆位点。进入受体细胞后，一般是能够以不同的形式进行复制。含有供选择克隆子的标记基因。克隆载体必须是安全的。2.3基因克隆载体克隆载体种类按构建克隆载体的材料来源分:质粒克隆载体、病毒（噬菌体）克隆载体、线粒体克隆载、人工染色体克隆载体、叶绿体克隆载体......按克隆载体的用途分:一般克隆载体、表达载体、建库载体、T或U载体......基因工程2.3基因克隆载体按克隆载体的受体生物分:原核生物克隆载体大肠杆菌克隆载体、放线菌克隆载体......真核生物克隆载体酵母克隆载体、植物克隆载体、动物克隆载体、人克隆载体......基因工程2.3基因克隆载体克隆载体种类含义：以质粒DNA分子为基础构建的克隆载体，必须含有质粒的复制起始位点。种类：大肠杆菌质粒载体蓝藻穿梭质粒载体农杆菌Ti质粒载体酵母2μm质粒载体......2.3.1质粒克隆载体基因工程2.3基因克隆载体质粒DNA基因工程2.3.1质粒克隆载体pBR322简图基因工程2.3.1质粒克隆载体基因工程2.3.1质粒克隆载体基因工程2.3.1质粒克隆载体基因工程2.3.1质粒克隆载体基因工程2.3.1质粒克隆载体含义以病毒（噬菌体）DNA或cDNA为主构建的克隆载体，或者通过转染直接进入宿主细胞，或者包装成病毒颗粒后通过转导进入宿主细胞。种类噬菌体克隆载体：λ噬菌体克隆载体Cosmid载体植物病毒克隆载体：CaMV克隆载体动物病毒克隆载体：痘苗病毒载体腺病毒载体反转录病毒克隆载体2.3.2病毒（噬菌体）克隆载体基因工程2.3基因克隆载体入噬菌体载体gtwes-λB基因工程2.3.2病毒（噬菌体）克隆载体基因工程2.3.2病毒（噬菌体）克隆载体痘苗病毒载体示意图基因工程2.3.2病毒（噬菌体）克隆载体2.3.3人工染色体载体——大DNA片段克隆载体（1）含义：指能在宿主细胞中稳定地复制并准确传递给子细胞的人工构建的染色体。（2）特点：能容纳长达1000kb以上的外源DNA片段。（3）用途：构建基因组文库,克隆和转移完整的高分子量基因,基因功能鉴定,基因治疗……基因工程2.3基因克隆载体（4）类型：线形的人工染色体：必须含有端粒、着丝粒和复制起始区。包含：酵母人工染色体（YAC)人类人工染色体（HAC)哺乳动物人工染色体（MAC)环形的人工染色体：不需要端粒和着丝粒，但必须含有合适的复制起始区。包含：细菌人工染色体(BAC)源于噬菌体Ｐ1的人工染色体(PAC)双元细菌人工染色体(BIBAC)可转化人工染色体(TAC)基因工程2.3.3人工染色体载体——大DNA片段克隆载体基因工程2.3.3人工染色体载体——大DNA片段克隆载体基因工程2.3.3人工染色体载体——大DNA片段克隆载体基因工程2.3.3人工染色体载体——大DNA片段克隆载体基因工程2.3.3人工染色体载体——大DNA片段克隆载体2.3.4体内同源重组整合载体（系统）2.3.4.1常规基因整合平台系统内源平台双交换置换载体内源平台双交换插入载体内源平台单交换插入载体外源平台双交换插入载体基因工程2.3基因克隆载体基因工程2.3.4.1常规基因整合平台系统loxP位点序列示意图2.3.4.2基于噬菌体P1的Cre/lox定位重组系统基因工程2.3.4体内同源重组整合载体（系统）基因工程2.3.4.2基于噬菌体P1的Cre/lox定位重组系统2.4.1目的基因来源目的基因：在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。目的基因的生物来源:真核生物染色体基因组原核生物染色体基因组质粒基因组病毒（噬菌体）基因组线粒体基因组叶绿体基因组基因工程2基因工程2.4获得目的基因2.4.2分离目的基因的途径2.4.2.1利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离目的基因基因工程2.4获得目的基因PCR扩增含目的基因DNA示意基因工程2.4.2分离目的基因的途径2.4.2.2利用PCR直接扩增目的基因基因工程2.4.2分离目的基因的途径2.4.2.3目的基因的化学合成2.4.2.4通过构建基因组文库或cDNA文库分离的基因基因工程2.4.2分离目的基因的途径基因工程2.4.2.4通过构建基因组文库或cDNA文库分离目的基因2.5.1受体细胞（定义，特点，P42）2.5.1.1原核生物种类：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌、棒状杆菌、放线菌等基因工程2基因工程2.5目的基因导入受体细胞特点：大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入;没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦;基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和质体基因组，便于