2蛋白质化学

2蛋白质化学第二章蛋白质化学2.1氨基酸2.1.1蛋白质氨基酸的结构及分类2.1.2氨基酸的理化性质2.2肽2.2.1肽和肽链的结构及命名2.2.2重要的天然寡肽2.3蛋白质的分子结构2.3.1蛋白质的一级结构2.3.2蛋白质的构象和维持构象的作用力2.3.3蛋白质的二级结构2.3.4蛋白质的三级结构2.3.5蛋白质的超二级结构和结构域2.3.6蛋白质的四级结构2.4蛋白质结构与功能的关系2.4.1一级结构与功能的关系2.4.2空间结构与功能的关系2.5蛋白质的重要性质2.5.1蛋白质的相对分子质量2.5.2蛋白质的两性解离及等电点2.5.3蛋白质的胶体性质2.5.4蛋白质的沉淀反应2.5.5蛋白质的变性与复性2.5.6蛋白质的紫外吸收与呈色反应2.6蛋白质的分类2.6.1简单蛋白质2.6.2结合蛋白质2.7蛋白质的分离提纯及应用2.7.1蛋白质分离纯化的一般原则2.7.2蛋白质的应用第二章蛋白质化学本章提要蛋白质是由20种L-α-氨基酸以肽键相连构成的生物大分子。各氨基酸的特征基团R侧基决定了该氨基酸的类别和性质，如酸碱性、紫外吸收、pI、亲水性等。蛋白质由于含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸而在280nm有吸收峰。蛋白质一级结构指肽链中氨基酸排列顺序。二级结构是肽链上不同肽段的空间结构，叫作构象单元，包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲，维持其结构稳定的是主链形成的氢键。三级结构是多肽在二级结构基础上通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠、借助次级键维系使各构象单元相互配置而形成的特定构象。超二级结构和结构域是介于二、三级结构之间的一个结构层次。四级结构由多个蛋白亚基组成，其中每一条多肽或蛋白单体称为亚基。蛋白质复杂的组成和结构是其多种多样生物功能的基础，蛋白质一级结构决定高级结构，后者又决定功能。蛋白质的两性解离、胶体性、沉淀反应、变性与复性等性质与其一级结构有关，是制定蛋白质研究技术的重要依据。蛋白质(protein)是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动的体现者：①酶是以蛋白质为主要成分的生物催化剂，代谢反应几乎都是在酶的催化下进行的。②结构蛋白参与细胞和组织的建成，如微管蛋白、伸展蛋白、胶原蛋白、膜蛋白、角蛋白等。③某些动物激素是蛋白质，如胰岛素、生长素、促卵泡激素、促甲状腺激素等，在代谢调节中具有十分重要的作用。④运动蛋白如肌肉中的肌动蛋白、肌球蛋白(收缩蛋白)以及鞭毛和纤毛蛋白与肌肉收缩和细胞运动有关。⑤高等动物的抗体、补体、干扰素等蛋白质具有防御功能。⑥某些蛋白质具有运输功能，如血红蛋白和肌红蛋白运输氧；脂蛋白运输脂类；细胞色素和铁氧还蛋白传递电子；细胞膜上的离子通道、离子泵、载体等运输离子和代谢物。⑦激素和神经递质的受体蛋白有接受和传递信息的功能。细胞表面抗原参与免疫反应和细胞识别。⑧染色质蛋白、阻遏蛋白、转录因子等参与基因表达的调控；细胞周期蛋白等具有调控细胞分裂、增殖、生长、分化的功能。⑨种子贮藏蛋白、卵白蛋白、酪蛋白、血浆白蛋白等具有贮存氨基酸和蛋白质的功能。此外，如视网膜上感觉光信号的视色素，味蕾上的味觉蛋白，某些植物、昆虫、微生物产生的毒素蛋白，各有其独特的功能。据估计，大肠杆菌细胞中约有3000种不同的蛋白质，真核细胞中则有大约100000种蛋白质。根据蛋白质的元素分析，发现它们除含C、H、O外，还含有N和少量S，部分蛋白质还含有P和某些微量元素，如Fe、Cu、Mo、Zn、I和Se等。蛋白质中N的平均含量为16％，即1mg蛋白氮相当于625mg蛋白质，这就是凯氏定氮法测定蛋白质含量的根据。2．1氨基酸尽管在各种生物体内已发现了180多种氨基酸(aminoacid，AA)，但参与组成蛋白质的氨基酸只有20种，称为蛋白质氨基酸，某些蛋白质中的稀有氨基酸组分都是基本氨基酸参入多肽链后经酶促修饰形成的，不参与蛋白质组成的氨基酸，称为非蛋白质氨基酸。2．1．1蛋白质氨基酸的结构及分类蛋白质氨基酸是蛋白质的基本结构单位或构件分子，生物体内构成蛋白质的氨基酸，除脯氨酸是一种α-亚氨基酸外，其余的都是α-氨基酸，除没有手性碳原子的甘氨酸外，其它蛋白质氨基酸均为L-型氨基酸。图2-1a氨基酸的基本结构：四个不同基团连接在α-碳原子周围；b氨基酸的两种立体异构体可见20种蛋白质氨基酸在结构上的差别仅在于侧链基团R的不同。通常根据R基团的性质把这20种氨基酸分为非极性氨基酸(疏水氨基酸)和极性氨基酸(亲水氨基酸)两大类，后者又可分为酸性氨基酸、碱性氨基酸和非解离的极性氨基酸，它们的名称、符号和结构式见表2-1。此外也可按R基团的结构特点把氨基酸划分成脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和杂环氨基酸。还可从营养学的角度将其分为非必需氨基酸和必需氨基酸，前者可由机体自行合成，后者在某些生物体内(如人类和大白鼠)不能合成或合成量不足以维持正常的生长发育，因此必须依赖食物供给。10种必需氨基酸中L-精氨酸和L-组氨酸尚可少量合成，因此也称为半必需氨基酸。2.1.2氨基酸的理化性质2.1.2.1氨基酸的两性解离与等电点氨基酸同时含有氨基和羧基，是两性电解质，在水溶液或结晶内基本上均以兼性离子或偶极离子的形式存在。氨基酸的兼性离子在酸性溶液中可接受质子形成阳离子，在碱性溶液中则释放质子形成阴离子。以甘氨酸为例:K2’K1’上式中K1′和K2′分别代表α-碳原子上—COOH和—NH+3的表观解离常数，K1′=［H+］［R±］/［R+］，K2′=［H+］［R-］/［R±］若以pH表示［H+］，上式可写成：pH＝pK1′lg(［R±］/［R+］)和pH＝pK2′+lg(［R-］/［R±］)图2-2甘氨酸的滴定曲线通常可以酸和碱分别滴定氨基酸求出pK1′和pK2′，例如1mol甘氨酸溶于水时，溶液pH为5.97，分别用标准NaOH和HCl滴定，以溶液pH为纵坐标，加入HCl和NaOH的mol数为横坐标作图，得到滴定曲线(图2-2)。甘氨酸的滴定曲线十分重要的特点就是在pH234和pH9.60处有两个“拐点”，分别为其pK1′和pK2′。氨基酸的两性解离是其最重要的性质，各解离基团的pK值也十分重要，据此可以计算出任一pH条件下氨基酸各种解离形成的相对浓度及其pI值。2.1.2.2氨基酸的光学性质基本氨基酸除甘氨酸外，其α-碳均为不对称碳原子或手性中心，因此有L-和D-两种类型的光学异构体。自然界的氨基酸主要以L-型存在。氨基酸的构型与旋光方向没有直接对应的关系，各种L-型氨基酸中有的为左旋，有的为右旋，同一种L-型氨基酸在不同溶剂中测定时，其旋光方向及比旋光值也会不同。蛋白质水解得到的α-氨基酸都属于L-型，所以习惯上书写时都不标明构型和旋光方向(图2-1)。20种蛋白质氨基酸在可见光区域均无光吸收，在远紫外区(220nm)均有光吸收。R基团含有芳香环共轭双键系统的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，在近紫外区(220～300nm)有光吸收，其最大光吸收(λmax)分别为279nm，278nm和259nm。蛋白质由于含有这些氨基酸，一般最大光吸收在280nm波长处，因此能利用分光光度法很方便地测定蛋白质含量。2.1.2.3氨基酸的重要化学反应1.与茚三酮反应在弱酸性条件下，氨基酸与茚三酮共热，生成一种紫色化合物。脯氨酸或羟脯氨酸与茚三酮生成黄色化合物。此反应经常用于氨基酸的定性和定量分析。2与2，4-二硝基氟苯反应在弱碱性溶液中，氨基酸的α-氨基易与2，4-二硝基氟苯(DNFB或FDNB)反应，生成黄色的二硝基苯氨基酸(DNP-AA)：此反应最初被Sanger用于测定肽链N-末端氨基酸，又被称为Sanger反应。3与异硫氰酸苯酯反应在弱碱性条件下，氨基酸的α-氨基易与异硫氰酸苯酯(PITC)反应，生成苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中与酸作用而环化，生成苯乙内酰硫脲(PTH)衍生物.蛋白质多肽链N-末端氨基酸的α-氨基也可以与PITC发生上述反应生成PTH-肽，在酸性溶液中释放出末端的PTH-氨基酸和比原来少一个氨基酸残基的多肽链，所得的PTH-氨基酸用层析法鉴定，即可确定肽链N-末端氨基酸的种类。剩余的肽链重复应用此方法测定其N-端的第二个氨基酸，如此重复就可测定多肽链全部序列。由于Edman成功地将此方法用于氨基酸序列分析，故又称此反应为Edman反应。目前根据此原理设计出蛋白质顺序测定仪(Proteinsequencer)，大大提高了蛋白质测序的效率。2.2肽氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水形成肽(peptide)，蛋白质是氨基酸通过肽键连接在一起的线性序列。生物体内存在各种长短不同的肽链。许多小肽具有特殊生物活性。2.2.1肽和肽链的结构及命名最简单的肽由两个氨基酸通过一个肽键连接而成，称为二肽；随着所含氨基酸数目的增加，依次称为三肽、四肽、五肽等。由于形成肽键的α-羧基与α-氨基之间缩合释放出一分子水，肽链中的氨基酸已不是完整的分子，因而称为氨基酸残基。通常，肽链的一端含有一个游离的α-氨基，另一端则保留一个游离的α-羧基。按规定肽链的氨基酸排列顺序从其氨基末端(N-末端)开始，到羧基末端(C-末端)终止，而且通常总是把N-末端氨基酸残基放在左边，C末端氨基酸残基放在右边，如下图所示：N-末端肽单位肽键C-末端不难看出，多肽链的骨架均由重复的肽单位排列而成，称为主链；不同的多肽链氨基酸顺序不同。小分子肽一般按其氨基酸残基排列顺序命名，如Tyr-Gly-Gly-Phe-Met称为酪氨酰甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰蛋氨酸，这是一种从脑中分离出来的，具有类似吗啡镇痛功能的物质，因此又称为脑啡肽。肽键中的亚氨基虽然不能解离，但肽链带有游离的N-端α-NH2和C-端α-COOH，加上部分氨基酸可解离的R基团，因而与氨基酸一样具有两性解离的性质。肽链末端α-NH2与α-COOH的间隔比游离氨基酸中的大，它们之间的静电引力较弱，因此α-羧基的pK1′值比游离氨基酸中的大一些；α-氨基的pK2′值比游离氨基酸中的小一些，侧链基团的pKR′变化不大。肽的化学反应与氨基酸一样，游离的α-氨基、α-羧基、R基团可发生与氨基酸中相应基团类似的反应，如茚三酮反应、Sanger反应、Edman反应等。含有两个以上肽键的化合物在碱性溶液中与Cu2+生成紫红色到蓝紫色的络合物，称为双缩脲反应，可用以测定多肽和蛋白质含量。2．2．2重要的天然寡肽生物体内有许多以游离态存在的小肽，具有各种特殊的生物学功能。已知很多动物激素属于肽类物质，如下丘脑分泌的促甲状腺素释放因子(TRH，3肽)、促黄体生成激素释放因子(LRF，10肽)、生长激素释放抑制因子(GRIF，14肽)、加压素(ADH，8肽))；脑垂体分泌的促肾上腺皮质激素(ACTH，9肽)；胰岛α-细胞分泌的胰高血糖素(29肽)等；某些神经递质，如前面提到的脑啡肽(5肽)和β-内啡肽(31肽)等。某些抗菌素也是肽或肽衍生物，如短杆菌肽S(环10肽)，放线菌素D和多粘菌素E等。谷胱甘肽(Glutathione)是广泛分布于生物体内的一种3肽，由γ-谷氨酰胺-半胱氨酰-甘氨酸组成(见图2-3)。由于它的Cys残基含有游离的—SH基，常以GSH表示之。谷胱甘肽是某些氧化还原酶的辅酶，对巯基酶的—SH基有保护作用，且有防止过氧化物累积的功能。2．3蛋白质的分子结构蛋白质是生物大分子，虽然组成蛋白质的基本氨基酸为20种，但各种不同的蛋白质氨基酸残基数变化很大，少则50多个，多则千个以上，加之氨基酸排列顺序的差异及组合肽链数的不同，就形成了结构和功能都十分复杂和多样的蛋白质。目前已确认的蛋白质结构层次分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构，另外为了研究的方便，在二、三级结构之间又划分出超二级结构和结构域两个层次。2.3.1蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(primarystructure)即多肽链内氨基酸残基从N-末端到C-末端的排列顺序，或称氨基酸序列，是蛋白质最